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    聚乙二醇/β谷甾醇雙接枝殼聚糖共聚物納米粒的體外釋放與體內(nèi)分布考察

    2014-06-07 09:14:58
    中國藥業(yè) 2014年7期
    關(guān)鍵詞:谷甾醇載藥香豆素

    凌 柏

    (江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科,江蘇 鹽城 224001)

    近年來,納米技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,以高分子材料包裹化學(xué)治療藥物制成載藥納米??梢赃_(dá)到緩釋、靶向給藥的目的,減少藥物的毒副作用[1]。如用脂質(zhì)體包裹阿霉素,已在臨床上得到了應(yīng)用,但脂質(zhì)體本身靶向分布不理想,且包封率低、穩(wěn)定性差。因此,尋找更佳的載體材料是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。兩親性聚合物能在水性介質(zhì)中通過自組裝方式形成納米粒子。該納米粒具有獨(dú)特的核殼結(jié)構(gòu),適合作為疏水性藥物的載體;并且由于增強(qiáng)了滲透性和阻留效應(yīng),能在腫瘤病變部位富集,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的“被動(dòng)靶向性”,用作抗腫瘤藥物的載體時(shí)能增加藥物療效,降低藥物毒副作用。殼聚糖[2]是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖,具有無毒性、無刺激性、無免疫原性、可降解性及優(yōu)良的生物相容性,同時(shí)由于它含有某些有助于細(xì)胞黏附和保持細(xì)胞分化功能的信息,因此,殼聚糖及其衍生物已廣泛應(yīng)用于納米給藥載體[3-11]。本研究中以β谷甾醇為疏水組分、聚乙二醇(PEG)為親水組分接枝至殼聚糖,制備了一種新型殼聚糖衍生物——PEG/β谷甾醇雙接枝殼聚糖(PSC),在水中PSC可自組裝形成以β谷甾醇為疏水核心、PEG為親水外殼的核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒。PEG是親水柔性大分子,在納米粒外層形成的親水層可減弱血漿蛋白的吸附,減少肝、脾中巨噬細(xì)胞的吞噬,使納米粒在血液中具有“長循環(huán)”能力,而“長循環(huán)”能力是實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向的前提。β谷甾醇是人體需要的物質(zhì),具有很好的安全性和生物相容性,同時(shí)還可抑制膽固醇的吸收,維持膽固醇水平,降低動(dòng)脈粥樣硬化的可能性。本研究中主要對(duì)PSC納米粒的自組裝性能及體內(nèi)組織分布進(jìn)行了初步的探索與評(píng)價(jià)。

    1 儀器與試藥

    F-4600型熒光分光光度計(jì)(日本Olympus公司);DF-Z型集熱力磁力加熱攪拌器,KQ-ZOOKD型高頻率數(shù)控超聲清洗器(昆山超聲儀有限公司);SHZ-82型旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司);SCMO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海中生科技有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);85-1型恒溫磁力攪拌器(常州國華儀器有限公司);MIKRO-200R型高速冷凍離心機(jī)(德國Hettich);XW-80A型微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司)。

    PSC(實(shí)驗(yàn)室自制);聚乙二醇1000(PEG1K,西隴化工股份有限公司,CP,批號(hào)為120315);聚乙二醇2000(PEG2K,西隴化工股份有限公司,CP,批號(hào)為120730);香豆素-6,羅丹明B(上海紫一試劑廠,AR,批號(hào)為 20130225);丁二酸酐(CP,≥99.0%,批號(hào)為 T20100412);β 谷甾醇(>75.0% ,批號(hào)為 A1203123);葉酸,四氫呋喃(THF,≥99.0%,批號(hào)為 T20111028);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,批號(hào)為 T201110511);草酰氯(阿拉丁,CP,≥98.0%,批號(hào)為T200880325);氫化鈣(阿拉丁,AR,批號(hào)為C1201027);甲烷磺酸(阿拉丁,99.0%,批號(hào)為39004);乙酸乙酯,甲醇,無水乙醇等其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 PSC及其納米粒制備

    PSC:將PEG1K及PEG2K溶于二氯甲烷,加入丁二酸酐及DMF,加熱回流12 h;旋轉(zhuǎn)蒸干后,加入乙酸乙酯重結(jié)晶2次,沉淀析出時(shí)抽濾,濾餅晾干得羧化PEG;將羧化PEG溶于二氯甲烷,加入草酰氯,回流反應(yīng)12 h,旋轉(zhuǎn)蒸干得PEG酰氯。將β谷甾醇溶于二氯甲烷,加入丁二酸酐及DMF,加熱回流12 h。旋干,加入蒸餾水?dāng)嚢?,抽濾,濾餅干燥得羧化β谷甾醇;將羧化β谷甾醇溶于二氯甲烷,加入草酰氯,回流反應(yīng)12 h,旋干,即得β谷甾醇酰氯。將殼聚糖溶于甲烷磺酸,先后加入β谷甾醇酰氯與PEG酰氯,50℃攪拌2 h,冰浴下加入適量蒸餾水終止反應(yīng),混合液轉(zhuǎn)入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500)透析至中性,抽濾,濾液凍干,即得PSC。

    空白和載香豆素-6的PSC納米粒:取適量PSC樣品,分散于水中,室溫?cái)嚢? h,冰浴下以脈沖式超聲儀超聲20 min(輸出功率100 W,工作2 s,間歇2 s),即得空白PSC納米粒懸液。取適量PSC與香豆素-6,溶解于乙醇中,攪拌30 min,裝入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500)透析12 h,即得載香豆素-6的PSC納米粒懸液。

    2.2 臨界聚集濃度(CAC)測定

    采用穩(wěn)態(tài)熒光探針法,考察PSC納米粒在水溶液中的CAC。將PSC分散于水中,超聲溶解,稀釋至不同質(zhì)量濃度(1.0×10-3~1.0 ×10-1g/L),備用。精密量取 50 μL 芘的甲醇溶液(6.0 ×10-4mol/L),置5 mL容量瓶中,氮?dú)獯蹈?。精密量? mL不同濃度的納米粒懸液,分別加至吹干的容量瓶中,超聲1 h。激發(fā)波長λex=337 nm,激發(fā)波長狹縫寬度5 nm,發(fā)射波長狹縫寬度10 nm,以熒光分光光度計(jì)記錄各樣品的發(fā)射光譜。以樣品在發(fā)射波長為384 nm和373 nm波長處熒光強(qiáng)度的比值 I384/I373對(duì)樣品質(zhì)量濃度 C(g/L)的對(duì)數(shù)值logC作圖,計(jì)算PSC納米粒的CAC值。結(jié)果見圖1。芘是一種脂溶性熒光探針,在極性環(huán)境中的熒光極弱,而在非極性環(huán)境中的熒光很強(qiáng),故當(dāng)水中有納米?;蚴杷Y(jié)構(gòu)域生成時(shí),芘分子自發(fā)由水相向疏水結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移,其熒光強(qiáng)度顯著增加。由圖 1 可見,在低質(zhì)量濃度時(shí),PSCI384/I373值為 1.9~2.2,與芘在水中的比值接近,且變化不大;當(dāng)質(zhì)量濃度逐漸增大時(shí),I384/I373突然降低,變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為PSC的CAC。計(jì)算得PSC的CAC值為0.02 g/L,低于許多兩親性小分子物質(zhì)的臨界膠束濃度。

    2.3 載藥量與包封率測定

    圖1 芘發(fā)射光譜 I384/I373與PSC質(zhì)量濃度的關(guān)系

    精密稱取一定量的PSC與香豆素-6(質(zhì)量為 M0),溶解于乙醇中,攪拌30 min,裝入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500)透析12 h,將得到的載香豆素-6的PSC納米粒懸液用0.45 μm微孔濾膜過濾,精密測定濾液體積 V。取0.5 mL濾液,與4.5 mL甲醇混勻,超聲5 min,12 000 r/min,離心10 min,上清液用熒光分光光度計(jì)測定香豆素-6的熒光強(qiáng)度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到香豆素-6濃度 C。另取1 mL濾液,冷凍干燥后精密稱定質(zhì)量 M。計(jì)算載藥量(loading capacity,LC)和包封率(encapsulation efficiency,EE),LC(%,w/w)=[(C×V×10)/(M×V)]×100%,EE(%,w/w)=[(C×V×10)/M0]×100%。結(jié)果PSC納米粒對(duì)香豆素-6的包封率為75%,載藥量為3.3%,表明透析法可有效將香豆素-6載入納米粒內(nèi)核。

    2.4 PSC納米粒體外釋放行為考察

    以疏水性熒光物質(zhì)香豆素-6為模型藥物,采用透析法制備載香豆素-6的PSC納米粒,以pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)為釋放介質(zhì),考察其體外釋放行為。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將香豆素-6稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.024 4,0.012 2,0.006 1,0.004 1,0.003 1,0.001 5,0.001 2 μg/mL 的甲醇溶液,采用熒光分光光度計(jì)(λex=446 nm,λem=510 nm,λex和λem的狹縫寬度均為10 nm)測定不同質(zhì)量濃度香豆素-6溶液的熒光強(qiáng)度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為 Y=169 991 X+7.26,R2=0.999 7(n=7)。結(jié)果表明,香豆素 -6 質(zhì)量濃度在0.001 2~0.024 4 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系。

    方法專屬性考察:在相同條件下(λex=446 nm,λem=510 nm,λex和λem的狹縫寬度均為10 nm),用熒光分光光度計(jì)檢測空白PSC納米粒溶液與釋放介質(zhì),考察對(duì)香豆素-6的測定是否有干擾。結(jié)果在相同熒光光度計(jì)測定條件下,PSC空白納米粒及釋放介質(zhì)PBS對(duì)香豆素-6的測定無干擾。

    釋放度測定與釋放曲線繪制:采用透析法漏槽條件考察載藥膠束的體外釋放情況。將載香豆素-6的PSC納米粒溶液裝入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500),再浸入裝有PBS(pH=7.4)100 mL的燒杯中,置恒溫振蕩器中,37℃,100 r/min振搖。分別于 15 min,30 min,1 h,2 h,3 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h 時(shí)將釋放介質(zhì)全部取出,更換新鮮的PBS 100 mL;同時(shí),從取出的100 mL釋放介質(zhì)中精密吸取10 mL,用乙酸乙酯萃取3次,合并3次的有機(jī)層,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮干溶劑,殘?jiān)? mL甲醇溶解后用熒光分光光度計(jì)檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放量,得累積釋放量及累積釋放率,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、累積釋放率為縱坐標(biāo)作香豆素-6的釋放曲線圖,見圖2??梢?,載香豆素-6的PSC納米粒在30 min累積釋放率約為23%,4 h約為56%,8 h約為68%,24 h約為98%,呈現(xiàn)出先突釋后緩釋的特點(diǎn),具有一定的緩釋能力。

    2.5 載藥PSC納米粒組織分布考察

    圖2 載香豆素-6的PSC納米粒釋放曲線圖(n=3)

    藥品準(zhǔn)備:將100 mg PSC1K溶于2.5 mL乙醇中,并加入5 mg香豆素,攪拌30 min,裝入10 cm的透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500),透析12 h,過濾,冷凍干燥,取干燥品配成質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液。載藥PSC2K納米粒的處理方法相同。

    給藥設(shè)計(jì)及樣本制作:取昆明小鼠18只(雌性,平均體重為18 g),隨機(jī)分為6組,每組3只。前3組小鼠尾靜脈注射載藥PSC1K納米粒溶液0.3 mL,后3組小鼠尾靜脈注射載藥PSC2K納米粒溶液0.3 mL。于給藥后1,4,8 h摘眼球取血,置以1%肝素抗凝的EP管中。隨即頸椎脫臼處死小鼠,迅速取出心、肝、脾、肺、腎、腦,生理鹽水洗去殘余血液,去除多余結(jié)締組織,濾紙吸干,稱重后裝入EP管。所有樣品均置冰箱內(nèi)保存,備用。

    樣本處理與檢測:取各組織樣品0.1 g(不足0.1 g的按實(shí)際質(zhì)量),加0.7 mL生理鹽水勻漿;勻漿液中加入2.8 mL甲醇,渦旋5 min,14 000 r/min離心 10 min;取上清0.2 mL用甲醇稀釋10倍后熒光分光光度計(jì)檢測。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:配置質(zhì)量濃度為 0.001~0.03 μg/mL 的香豆素甲醇溶液,用熒光分光光度計(jì)測定不同溶液的熒光強(qiáng)度。以香豆素甲醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。香豆素線性回歸方程為 Y=299 680X+94.672,R2=0.999 4。

    組織分布:PSC1K溶液和PSC2K溶液經(jīng)小鼠尾靜脈注射后,以不同時(shí)間各組織中香豆素-6的含量來評(píng)價(jià)制劑在小鼠體內(nèi)的組織分布。結(jié)果見圖3。可見,PSC1K納米粒尾靜脈注射后,在各個(gè)組織的分布量于1 h達(dá)峰值,之后隨著時(shí)間的延長藥物分布量呈下降趨勢。給藥1 h時(shí),各組織中肺的藥物分布量最高,其次是肝、脾;PSC2K納米粒尾靜脈注射后,在各組織的分布量在1 h達(dá)峰值,之后隨時(shí)間的延長藥物分布量呈下降趨勢。給藥1 h時(shí),各組織中心的藥物分布量最高,而在2 h時(shí)心的藥物分布量迅速降低。

    圖3 納米粒小鼠體內(nèi)的組織分布直方圖

    3 討論

    由圖1可見,本試驗(yàn)中合成的PSC具有較小的CAC值,說明PSC納米粒具有較強(qiáng)的勢力學(xué)穩(wěn)定性。用藥時(shí),即使被血液稀釋到很低的濃度,依然能保持納米粒結(jié)構(gòu),避免了藥物的泄漏,保障了用藥安全。

    PSC1K溶液和PSC2K溶液經(jīng)小鼠尾靜脈注射,以不同時(shí)間各組織中香豆素-6的含量來評(píng)價(jià)制劑在小鼠體內(nèi)的組織分布,了解載藥PSC1K納米粒及載藥PSC2K納米粒小鼠體內(nèi)的組織分布情況(圖3)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PSC1K納米粒尾靜脈注射后,在各個(gè)組織的分布量在1 h達(dá)峰值,之后隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢;給藥1 h時(shí),各組織中肺的藥物分布量最高,其次是肝、脾。這可能是由于PSC納米粒帶正電,與肺黏膜表面的負(fù)電荷基團(tuán)相互作用,導(dǎo)致肺中藥物分布量較高。肝、脾作為單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)的主要器官,對(duì)注射入體內(nèi)的微小粒子具有吞噬作用,因此這兩個(gè)組織中藥物分布量也較高。腎與心的藥物分布量很低,表明PSC納米粒給藥不會(huì)造成腎毒性和心臟毒性。與此同時(shí),PSC2K納米粒尾靜脈注射后,與PSC1K相似,在各個(gè)組織的分布量在1 h達(dá)峰值,之后隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢;給藥1 h時(shí),各組織中心的藥物分布量最高,而在2 h時(shí)心臟的藥物分布量迅速降低,這可能是由于殘留在心臟的血液未被清洗干凈,而血中的藥物分布量較高所致。PSC2K在肺、肝、脾中的分布量較高,但與PSC1K相比,其被肝、脾攝取的量下降,這可能是因?yàn)镻SC2K修飾了更長的PEG鏈,對(duì)避免被單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)吞噬具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。值得注意的是,PSC2K與PSC1K相比,在腦部的藥物分布量顯著提高,一方面可能是由于PSC2K的循環(huán)時(shí)間更長,另一方面可能相對(duì)分子質(zhì)量為2 000的PEG更容易與血腦屏障的細(xì)胞膜融合而使納米??缪X屏障。

    總之,本試驗(yàn)成功地考察了新型兩親性殼聚糖衍生物PSC在水中自組裝形成納米粒的性能及組織分布。PSC作為一種新型的載藥膠束,在水中可自組裝成納米粒;臨界聚集濃度為0.02 g/L,具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性;載藥量為3.3%,包封率為75%,能夠有效包載香豆素,顯著增加其溶解度。載香豆素-6的PSC納米粒在30 min累積釋放率約為23%,4 h約為56%,8 h約為68%,24 h累積釋放率約為98%,表現(xiàn)為先突釋后緩釋的特點(diǎn),具有一定的緩釋能力。載藥PSC納米粒在肺部濃度較高,可能由于其荷正電與負(fù)電性的肺黏膜相互作用造成;由于巨噬細(xì)胞的吞噬在肝、脾中濃度也較高,修飾較長鏈的PEG可減少被肝、脾的吞噬;同時(shí),修飾較長鏈PEG的納米粒比修飾短鏈PEG的納米粒在腦部的分布有所增加;兩種PSC納米粒在腎、心中分布均較少。上述結(jié)果表明,PSC膠束作為疏水性的抗癌藥物載體,具有良好的發(fā)展前景。

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