吡格列酮對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子β-1的影響

汪姍，葉山東，孫文佳，胡圓圓

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001）

吡格列酮對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子β-1的影響

汪姍，葉山東，孫文佳，胡圓圓

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001）

目的觀察吡格列酮（PIO）對高糖（HG）培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞（MCs）p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和轉(zhuǎn)化生長因子β-1（TGF-β1）表達(dá)的影響，探討PIO腎保護(hù)作用及機(jī)制。方法體外培養(yǎng)MCs，取對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×105／孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同步化后隨機(jī)分為正常對照（NG）組、HG組、p38MAPK抑制劑（S）組及PIO（P）組。Western blot測定磷酸化p38MAPK（p-p38）和總p38MAPK（t-p38）蛋白含量，半定量RT-PCR測定細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果與NG組比較，HG組細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK含量和TGF-β1mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；與HG組比較，p38MAPK抑制劑顯著抑制HG刺激的細(xì)胞內(nèi)p38MAPK活性和TGF-β1表達(dá)（P＜0.05）；與HG組比較，P組細(xì)胞內(nèi)上述變化亦明顯降低（P＜0.05），與S組相似；p38MAPK活性和TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.587，P＜0.01）。結(jié)論P(yáng)IO可抑制腎小球系膜p38MAPK通路，降低TGF-β1表達(dá)，該作用可能與其腎臟保護(hù)部分有關(guān)。

糖尿病腎??；腎小球系膜細(xì)胞；P38絲裂原活化蛋白激酶類；轉(zhuǎn)化生長因子β1；噻唑烷二酮類

圖1 各組P-P38MAPK、t-P38MAPK表達(dá)結(jié)果

圖2 各組MCs TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量

圖3 大鼠腎小球MCs P38MAPK蛋白表達(dá)量與TGFβ-1mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析

糖尿病腎?。―N）是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未明確。研究顯示p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是糖尿病多種致病因素共同信號(hào)通路的交匯點(diǎn)［1］。轉(zhuǎn)化生長因子β-1（TGF-β1）是一重要的細(xì)胞因子，對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，并通過多種機(jī)制參與糖尿病腎小球硬化的發(fā)生。PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮（PIO）是一類廣泛使用的抗糖尿病藥物，近來研究顯示其尚具有降糖之外的腎臟保護(hù)作用［2-3］，是否涉及p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)TGF-β1表達(dá)，尚未明確。本研究擬通過體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（MCs），比較觀察PIO和p38MAPK抑制劑（SB203580）對HG培養(yǎng)下的MCs p38MAPK和TGF-β1的影響，探討其可能的腎保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 MCs購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要藥物及試劑 DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；PIO由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司惠贈(zèng)；SB203580P、預(yù)染Marker購自美國Sigma公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒和ECL檢測液購自碧云天生物有限公司；抗鼠p38MAPK多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；抗鼠p-p38MAPK單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；β-actin抗體購自上海生工生物工程有限公司；辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京中杉公司；DMSO、Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑購自大連寶生物公司；PCR所用引物由大連寶生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MCs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM液中（Glu 5.6 mol／L），37℃，5%CO2。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以2× 105／孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同步化后按下列分組進(jìn)行處理：①正常對照組（NG組）：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（Glu 5.6 mmol／L）；②HG組：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（Glu 25 mmol／L）；③p38MAPK抑制劑組（S組）：HG＋SB203580（10μmol／L）；④PIO（P）組：HG＋PIO（10-6mmol／L）。SB203580預(yù)先刺激3 h，PIO預(yù)先干預(yù)24 h。以上各組標(biāo)本培養(yǎng)48 h后，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，每組重復(fù)4次。

1.2.2 Western blotting檢測腎組織磷酸化p38MAPK（p-p38）和總p38MAPK（t-p38）的表達(dá)分別收集細(xì)胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），脫脂奶粉封閉，一抗p-p38MAPK（1∶1 000）、t-p38MAPK（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）4℃過夜，洗膜，二抗（1∶5 000）孵育，ECL化學(xué)發(fā)光，X膠片顯影，Quantity One分析光密度值。

1.2.3 RT-PCR檢測MCs TGFβ-1 mRNA表達(dá)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作遵試劑說明。TGFβ-1引物序列為上游5＇-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C-3＇，下游5＇-CAC GATCATGTTGGA CAA CTG CTCC-3＇，目標(biāo)片段大小為298 bp。以GAPDH為內(nèi)參照，上游5＇-CTC TAC CCA CGG CAA GTTCAA-3’，下游5＇-GGA TGA CCT TGC CCA AGC-3＇，目標(biāo)片段515 bp。反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性3 min后，進(jìn)入94℃30 s變性、52℃60 s退火、72℃60 s延伸的熱循環(huán)，循環(huán)35次，終末延伸72℃10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照，進(jìn)行光密度掃描，以TGFβ-1／GAPDH條帶光密度比值表示TGFβ-1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較各組間差異，采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PIO和SB203580對HG培養(yǎng)的MCs p38MAPK磷酸化程度的影響 HG組p-p38MAPK水平為NG組的1.93倍（0.88±0.09比0.46±0.07，P＜0.01）。SB203580和PIO可顯著抑制HG介導(dǎo)的p38MAPK活化，分別為S組（0.57±0.06，P＜0.01）、P組（0.60±0.03，P＜0.01），S組與NG組（P＜0.05）、P組與NG組之間有差異（P＜0.05），P組與S組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間t-p38MAPK表達(dá)則無明顯變化，分別為（0.98±0.04，1.00± 0.03，1.00±0.06，0.99±0.05），見圖1。

2.2 PIO和SB203580對HG刺激下腎小球MCs TGFβ-1 mRNA的表達(dá) MCs經(jīng)HG處理后TGFβ-1表達(dá)量較NG組明顯增加（1.01±0.15vs 1.54± 0.16，P＜0.01）。PIO和SB203580均可顯著降低HG誘導(dǎo)的TGFβ-1高表達(dá)，分別為P組（1.30± 0.15，P＜0.05）、S組（1.18±0.12，P＜0.01），P組與S組、S組與NG組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。2.3 相關(guān)性分析 根據(jù)Pearson相關(guān)分析，MCs內(nèi)p38MAPK活性與TGFβ-1表達(dá)呈高度正相關(guān)（r＝0.719，P＜0.01），見圖3。

3 討論

DN的主要病理特點(diǎn)是MCs增殖、肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚。p38MAPK作為細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可通過增加核轉(zhuǎn)錄因子cAMP-反應(yīng)結(jié)合蛋白（CREB）、轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）水平，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、核因子-κB（NF-κB）、纖維粘連蛋白（FN）的表達(dá)，參與炎癥、應(yīng)激、細(xì)胞周期和凋亡等病理生理過程，加劇腎臟進(jìn)行性纖維化［1］。Sakai等［4］研究表明p38MAPK在糖尿病患者腎小管間質(zhì)中的表達(dá)與腎小管的損害呈正相關(guān)，阻斷p38MAPK通路有助于DN的預(yù)防和治療。TGF-β1被認(rèn)為是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化機(jī)制中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在DN相關(guān)生長因子網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位［5］。研究揭示［6］MAPK通路可介導(dǎo)TGF-β1誘生的系膜區(qū)基質(zhì)沉積。另一方面TGF-β1又可以活化p38MAPK，增加FN表達(dá)，且可被p38MAPK抑制劑阻斷［7］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HG刺激后，MCs p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯增加，且兩者高度相關(guān)，給予p38MAPK特異性抑制劑后，TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯減輕，提示p38MAPK在MCsTGF-β1的表達(dá)中起重要的介導(dǎo)作用，與文獻(xiàn)一致［8］。

研究證實(shí)PIO對腎臟具有保護(hù)作用，但有關(guān)其作用機(jī)制尚未明確［3，9-10］。Ji等［11］在對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PIO可抑制P38MAPK活化，降低脂多糖誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)和NO的生成，調(diào)節(jié)炎癥過程而發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予PIO干預(yù)后，HG誘導(dǎo)的MCs p38MAPK磷酸化水平降低，其作用與p38MAPK特異性抑制劑SB203580作用類似，提示PIO可抑制p38MAPK的過度活化，該作用可能與其上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，拮抗p38MAPK有關(guān)［12］。有關(guān)兩者拮抗的具體機(jī)制尚不清楚，Adams等［13］認(rèn)為兩者均可競爭PPAR-γ激活因子或磷酸化的Ser82。進(jìn)一步觀察顯示PIO可抑制MCs TGF-β1表達(dá)，其作用與SB203580相似，提示PIO部分通過抑制p38MAPK通路調(diào)控TGF-β1表達(dá)。

（本文圖1～3見插圖2-2）

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Effects of pioglitazone on the expressions of p38 m itogen-activated p rotein kinase and transform ing grow th factorβ-1 in cultured rat glomerular mesangial cells

WANG Shan，YE Shandong，SUN Wenjia，HU Yuanyuan （Department of Endocrinology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to AnhuiMedical University，Hefei230001，China）

YE Shandong，Email：ysd196406＠163.com

ObjectiveTo observe the effects of pioglitazone on the expressions of p38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）and transforming growth factorβ-1（TGF-β1）in cultured rat glomerular mesangial cells（MCs）and explore its reno-protectivemechanism.MethodsMCswere cultured in themedium with normal glucose concentration（group NG），high glucose concentration（group HG），p38MAPK special inhibitor（group S）and pioglitazone（group P）.The expression levels of phosphory1ated p38MAPK（p-p38）and total p38MAPK（t-p38）were measured by Western blot.The expressions of TGF-β1 mRNA were detected by semiquantitative RT-PCR.ResultsCompared with group NG，the p38MAPK activity and TGF-β1mRNA expression increased significantly（P＜0.01）in group HG.Compared with group HG，p38MAPK special inhibitor inhibitedmarkly HG-induced p38MAPK activity and TGF-β1 expression（P＜0.05）.When treated with pioglitazone，p38MAPK activity and TGF-β1 expression decreased（P＜0.05），which were similar to group S.p38MAPK activity was positively correlated with TGF-β1 expression（r＝0.587，P＜0.01）.Conlusions Pioglitazone can suppress TGF-β1 expression of MCs via p38MAPK pathway，which may contribute partly to its reno-protection.

Diabetic nephropathies；Mesangial cells；p38 mitogen-activated protein kinases；Transforming growth factor beta 1；Thiazolidinediones

R587.24

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.018

2013-08-10）

安徽省自然科學(xué)基金（11040606M161）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2011A157）

汪姍，碩士在讀，Email：nono142587＠163.com

葉山東，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：ysd196406＠163.com