山西黑豬肌細(xì)胞生成素基因部分序列的擴(kuò)增

劉勇

摘 要：肌細(xì)胞生成素在肌細(xì)胞的分化過程中起著關(guān)鍵的正向調(diào)節(jié)作用。根據(jù)豬的肌細(xì)胞生成素的基因序列設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物，以山西黑豬為研究對(duì)象，通過PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 493 bp的序列，經(jīng)測序和基因的同源性比對(duì)得出山西黑豬的基因序列與家豬等動(dòng)物有較高的同源性。結(jié)果表明：肌細(xì)胞生成素基因可能在山西黑豬肌肉組織發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為今后改良黑豬的肌肉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山西黑豬；肌細(xì)胞生成素；擴(kuò)增；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S828.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）06-0055-02

1 材料與方法

1.1 組織材料及試劑

1.1.1 材料

山西黑豬一頭，來自山西省原平市，取其腿部肌肉一塊，迅速投入液氮。用于RNA的提取。

1.1.2 主要試劑

Trizol 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA MarkerDL2000和Rnase抑制劑均購自大連TaKaRa公司。

1.2 RNA提取

將凍存于液氮的山西黑豬退腿部肌肉在液氮中研磨成粉后，按照Trizol試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟提取山西黑豬肌肉中的總RNA，用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢查提取的RNA的完整性，使用微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。并將其歸為500 ng/μL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增。

1.3 引物設(shè)計(jì)

對(duì)GeneBank中登錄豬的肌細(xì)胞生成素（myogenin）序列（X89007.1、AY912514.1和AY912513.1）進(jìn)行同源性比較，借助Primer5.0 plus軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增山西黑豬肌細(xì)胞生成素1對(duì)特異性引物，預(yù)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 493 bp，引物序列為： F： gtgcctgcctttgttagagc；R： catcctggcagacagtctca。由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

將提取的山西黑豬肌肉的總RNA，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 2 μL、特異上下游引物各0.5 μL、TaqE 0.25 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL、無菌水17.25 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s， 72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠、回收、純化后送交大連寶生物工程有限公司雙引物測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見與預(yù)期大小相符的特異性條帶（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

3 討論

山西黑豬是由巴克夏豬、 內(nèi)江豬、山西本地豬雜交培育而成?，F(xiàn)主要分布在大同、原平、河曲、五臺(tái)和太谷等市縣。其全身為黑色，繁殖力較高，抗逆性較強(qiáng)，耐粗飼生長速度快[1]。作為地方品種，挖掘其肉用方面的優(yōu)勢(shì)，提高其飼養(yǎng)量和生產(chǎn)量勢(shì)在必行。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，克隆產(chǎn)肉量和肉質(zhì)相關(guān)基因的序列，現(xiàn)實(shí)山西黑豬的肉質(zhì)改良是可行有效的方法。

肌肉的發(fā)育過程是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，受眾多的正向和負(fù)向調(diào)控因子的共同調(diào)控，其中生肌調(diào)節(jié)因子家族在肌肉發(fā)育過程中起著重要的正調(diào)控作用，并且控制著肌肉發(fā)育的整個(gè)過程。肌細(xì)胞生成素是生肌調(diào)節(jié)因子MYOD家族成員之一，在肌細(xì)胞的分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，目前它是研究畜禽肉質(zhì)性狀的一個(gè)重要候選基因[2-4]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1 493 bp的基因序列，與家豬、野豬、牛、馬、羊的同源性比較，同源性分別為：100 %、99 %、99 %、97 %?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（4篇，略）