• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究

    2014-05-30 03:56:46馮曉東陳國梁常海飛
    關(guān)鍵詞:駿棗共培養(yǎng)外植體

    馮曉東,陳國梁,喬 璟,常海飛

    (1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 延安 716000)

    棗樹分布于我國北方廣大地區(qū),一般生長在中溫帶與寒帶過渡帶,棗樹也是近年來黃河中下游流域退耕還林和發(fā)展經(jīng)濟(jì)林果的主要樹種之一。隨著棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和市場需求的變化,對棗樹品種及其品質(zhì)特性提出了更多、更高的要求,從而對棗品質(zhì)育種研究提出了新的目標(biāo)。利用基因工程方法建立一個完整、穩(wěn)定的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),不僅可為外源基因的導(dǎo)入奠定技術(shù)基礎(chǔ),還可推動品種的定向改良,縮短育種周期,創(chuàng)造出新的優(yōu)良品種[1]。

    植物基因工程育種的前提是建立一種簡便、快速、有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),以便把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞,進(jìn)而從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株,其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)[2,3]是當(dāng)前棗樹新品種培育研究中不可缺少的技術(shù),可將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后代而無需多代選育,因此具有較大的優(yōu)勢。雖然對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究已經(jīng)進(jìn)行多次改進(jìn),但仍存在一些問題,本試驗(yàn)以駿棗的愈傷組織為外植體,篩選適合駿棗愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基,對其再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了初步研究,為建立一種穩(wěn)妥可靠的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化方法提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    取健壯的繼代培養(yǎng)14 d駿棗(Zizyphus jujubeMill JunZao)無菌愈傷組織,由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院紅棗繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.2 工程農(nóng)桿菌

    工程農(nóng)桿菌菌株(根癌農(nóng)桿菌LBA4404,攜帶pART-GF1-2植物表達(dá)載體),該工程農(nóng)桿菌LBA4404-GF含gbss基因5'側(cè)翼序列及其驅(qū)動的正反向目的片段,其結(jié)構(gòu)如圖1所示:

    圖1 GBSS基因5'側(cè)翼序列驅(qū)動的植物表達(dá)干擾載體的構(gòu)建模式圖

    1.2 方法

    1.2.1 愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

    將同一生長狀態(tài)下的無菌愈傷組織接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行避光培養(yǎng),培養(yǎng)基為MS+6-BA0.4 mg/L+2,4-D1.2 mg/L。選取預(yù)培養(yǎng)6天,繼代14天的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

    1.2.2 工程農(nóng)桿菌的菌懸液制備

    從平板上挑取工程農(nóng)桿菌 LBA4404(含有pART-GF1-2)單菌落,接種于YEP液體培養(yǎng)基中(含 100 mg/LKan、50 mg/LStr),于恒溫 28℃搖床上260 rpm振蕩暗培養(yǎng)24~36 h活化。然后將活化好的菌液按1∶50進(jìn)行放大培養(yǎng),培養(yǎng)6~8 h,待工程菌生長達(dá)到對數(shù)生長期,菌活性最大時,倒入無菌離心管中,5000r/min離心5min,收集的菌體用MS液體培養(yǎng)基稀釋至 OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8 待用。

    1.2.3 卡那霉素選擇壓的確定

    將預(yù)培養(yǎng)后的駿棗無菌愈傷組織分別接種到含Kan 濃度為 0、25、50、75、100、125 mg/L 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每處理各水平外植體25個,每次處理重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度28℃,光周期12/d,光強(qiáng)1500~2000 lx,20 d后統(tǒng)計(jì)駿棗新愈傷組織的產(chǎn)生率。

    1.2.4 愈傷組織的浸染

    切取一定數(shù)量的、生長健壯駿棗無菌愈傷組織,切成0.5 cm左右的小塊,置于工程農(nóng)桿菌菌液(菌液 OD600值分別為 0.2、0.4、0.6、0.8)中浸染,浸染時間依次為5、10、15 min,取出轉(zhuǎn)化材料,用滅菌濾紙拭去其表面菌液,轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,于28℃暗處共培養(yǎng)。

    1.2.5 浸染外植體的脫菌與篩選

    將共培養(yǎng)后外植體轉(zhuǎn)入含250 mg/L頭孢霉素,125 mg/L卡那霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,并在脫菌與抗性篩選的過程中誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

    1.2.6 CTAB 法提取駿棗愈傷組織 DNA[4-6]

    選取抗Kan的愈傷組織0.5 g,用CTAB法提取DNA。

    1.2.7 愈傷組織的PCR檢測[7-8]

    以轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為模板,以pART-GF1-2LBA4404菌液作為陽性對照,未經(jīng)轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為陰性對照,水為空白對照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為800 bp,凝膠電泳瓊脂糖濃度選擇1.2%。

    PCR擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性(94℃,5 min);變性(94℃,50 s),退火(50℃,45 s),延伸(72℃,50 s),循環(huán)30次;最后延伸(72℃,10 min),4℃保存。

    1.2.8 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

    進(jìn)行9個批次的遺傳轉(zhuǎn)化,每個批次均浸染數(shù)十個駿棗外植體,統(tǒng)計(jì)浸染、共培養(yǎng)、脫菌與抗性篩選過程中外植體的損失,最后通過CTAB法提取DNA,并由PCR檢測鑒定目的基因?qū)腧E棗外植體的結(jié)果,計(jì)算遺傳轉(zhuǎn)化率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Kan對駿棗愈傷組織再生的影響

    從表2中可以看出當(dāng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不含Kan時,愈傷組織再生頻率可達(dá)90.5%;含Kan 25~75 mg/L時,愈傷組織再生受到抑制;含125 mg/L以上時,幾乎完全抑制了愈傷組織的再生;更大濃度時,愈傷組織再生率均為零,而且愈傷組織均迅速褐化死亡,以125mg/LKan作為駿棗愈傷組織的篩選濃度。

    2.2 預(yù)培養(yǎng)對愈傷組織再生的影響

    由表3可以看出,預(yù)培養(yǎng)6 d后浸染的駿棗愈傷組織再生頻率高于其他處理,表明駿棗愈傷組織預(yù)培養(yǎng)后浸染要好于未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的,且預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

    表1 Kan對駿棗愈傷組織再生的影響

    表2 受體材料預(yù)培養(yǎng)對愈傷組織再生的影響

    2.3 農(nóng)桿菌液濃度及浸染時間對共培養(yǎng)的影響

    從表可以看出看,雖然菌液濃度及浸染時間對共培養(yǎng)的影響不是很大,但以O(shè)D600為0.4~0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。

    表3 農(nóng)桿菌菌液濃度與浸染時間對共培養(yǎng)的影響

    2.4 駿棗愈傷組織DNA的PCR鑒定結(jié)果

    圖2 以gl-1/gl-6為引物的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

    圖2顯示,浸染過的駿棗愈傷組織1和2出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,且與工程菌質(zhì)粒的擴(kuò)增條帶在同一個水平上,表明工程菌的目的基因已經(jīng)整合至駿棗愈傷組織的DNA中。

    2.5 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    從表5統(tǒng)計(jì)結(jié)果看,經(jīng)PCR檢測到目的基因的愈傷組織僅出現(xiàn)在9個批次的3個批次中。試驗(yàn)中共浸染396個愈傷組織,產(chǎn)生了12個卡那霉素抗性愈傷組織,通過對抗性個體的PCR檢測驗(yàn)證,只有3個將外源基因轉(zhuǎn)移到了植物的基因組中,其最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。

    表4 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

    3 小結(jié)與討論

    建立高效的組織培養(yǎng)和再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)用駿棗愈傷組織作外植體,與農(nóng)桿菌共培養(yǎng),研究了轉(zhuǎn)化過程中影響轉(zhuǎn)化的各種因素,得到了適合駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的適合條件,初步實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化。

    3.1 駿棗愈傷組織對Kan選擇壓的確定

    不同植株對同一種類的抗生素敏感程度不同[9-10],同一種植株的不同器官對同一種類的抗生素敏感程度也不同。試驗(yàn)結(jié)果表明駿棗愈傷組織誘導(dǎo)的新愈傷組織對卡那霉素敏感,合適篩選濃度為125 mg/L。

    3.2 預(yù)培養(yǎng)時間

    預(yù)培養(yǎng)的目的一方面是使外植體盡快適應(yīng)新的生長條件,促進(jìn)細(xì)胞分裂,而分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA,因而可以提高轉(zhuǎn)化效率;另一方面是能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生[11]。棗樹為木本植物是含酚類物質(zhì)較多的一類植物,因此采用預(yù)培養(yǎng)這一步驟則顯得尤為重要。試驗(yàn)表明預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

    3.3 浸染濃度和侵染時間對共培養(yǎng)的影響

    在浸染過程中,菌液濃度和浸染時間是兩個主要參數(shù)。浸染濃度與時間值過小則因外植體上附著的菌體較少而降低農(nóng)桿菌的浸入,浸染濃度與時間值過大則會對外植體造成傷害,且在后續(xù)培養(yǎng)中很難抑制農(nóng)桿菌而引起污染。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌濃度在一定范圍內(nèi),濃度高時適當(dāng)縮短浸染時間,濃度低時適當(dāng)延長浸染時間均可以得到較高的轉(zhuǎn)化率[12]。試驗(yàn)表明菌液濃度和浸染時間對共培養(yǎng)影響不大,但以O(shè)D600為0.4~0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。試驗(yàn)表明,對于駿棗愈傷組織,共培養(yǎng)16d處理后的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。

    最后,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)PCR檢測,在9個批次中得到了2個批次的轉(zhuǎn)基因植株,初步證明外源目的基因已整合到駿棗基因組中。但遺傳轉(zhuǎn)化率較低,最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。至于建立完善的駿棗遺傳轉(zhuǎn)化體系及各參數(shù)的量化分析有待進(jìn)一步的研究。

    [1]何業(yè)華,林良斌,熊興華,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[R].分子植物育種,2003,11(5-6):683-686.

    [2]Xiaoling He,Susan C,Miyasaka,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of taro with a rice chitinase gene for improved tolerance to a fungal pathogen Sclerotium rolfsii[J].Plant Cell Rep,2008,27:903 -909.

    [3]Daxu Li,Qun Sun,Min Huang,et al.Agrobacterium - mediated genetic transformation of Elymus breviaristatus with Pseudomonas pseudoalcaligenes insecticidal protein gene

    [J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2007,89:159 -168.

    [4]謝一青,李志真,黃儒珠,等.光皮樺基因組DNA提取方

    法比較[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào).2006,23(6):664-668.[5]蘇應(yīng)娟,王艇,楊維東,等.羅漢松屬植物DNA的提取和

    RAPD分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,37:13-18.

    [6]黃少甫,趙志芬,陸軍,等.杉木DNA的快速提取[J].林業(yè)科學(xué)研究,1995,8(6):692 -693.

    [7]朱秀志,向成華,彭正松,等.峨眉含笑基因組DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),29(2):46-49.

    [8]劉興菊,湯新彩,梁海永,等.棗樹ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(5):62-65.

    [9]Ningxia Du,Paula M,Pijut.Agrobacterium - mediated transformation of Fraxinus pennsylva nica hypocotyls and plant regeneration[J].Plant Cell Rep,2009,28:915 -923.

    [10]Kyung -Hwan Kim,Yeon -Hee Lee,Donghern Kim,et al.

    Agrobacterium-mediated genetic transfor- mation of Pe

    rilla frutescens[J].Plant Cell Rep,2004,23:386 -390.[11]X.F.Gu,H.Meng,G.Qi,J.R.Zhang.Agrobacterium-mediated transformation of the winter jujube[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2008,94:23 -32.

    [12]尚愛芹,田傳衛(wèi),趙梁軍,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)北海道黃楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(3):409-414.

    猜你喜歡
    駿棗共培養(yǎng)外植體
    阿拉爾墾區(qū)不同樹齡駿棗果實(shí)外觀的比較
    種子科技(2024年3期)2024-03-07 10:52:54
    BMSCs-SCs共培養(yǎng)體系聯(lián)合異種神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究
    不同激素配比對紫花苜蓿幼苗4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響
    山西駿棗和梨棗果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的年動態(tài)變化及其比較
    紫錐菊不定根懸浮共培養(yǎng)中咖啡酸衍生物積累研究
    瀕危植物單性木蘭外植體啟動培養(yǎng)
    解決蘋果矮化砧M9外植體褐化現(xiàn)象的研究
    角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    幾種抗裂劑防治駿棗裂果的效果試驗(yàn)
    噻苯隆與赤霉素在駿棗上配合使用效果初報(bào)
    99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品乱久久久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 搡老岳熟女国产| 欧美黑人精品巨大| 亚洲视频免费观看视频| 日韩电影二区| avwww免费| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中文字幕制服av| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产精品成人久久小说| a 毛片基地| 999精品在线视频| 一区二区三区激情视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 人妻一区二区av| 国产在线免费精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产av又大| 日韩大片免费观看网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人国产av品久久久| 国产精品99久久99久久久不卡| a级毛片黄视频| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品国产a三级三级三级| av在线app专区| 新久久久久国产一级毛片| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久狼人影院| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线看a的网站| 国产黄频视频在线观看| 国产黄频视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| 老司机午夜福利在线观看视频 | 狠狠狠狠99中文字幕| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲av成人一区二区三| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产在视频线精品| 高清欧美精品videossex| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 欧美午夜高清在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩视频一区二区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 大香蕉久久成人网| 男人操女人黄网站| 国产国语露脸激情在线看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美日韩av久久| 一区二区三区激情视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品久久久人人做人人爽| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av国产av综合av卡| 国产色视频综合| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一区二区三区精品91| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费不卡黄色视频| 成人三级做爰电影| 老司机午夜福利在线观看视频 | 天天操日日干夜夜撸| 久久精品成人免费网站| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品免费大片| 久久人人爽人人片av| 日韩欧美一区视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产男女超爽视频在线观看| 人妻一区二区av| 免费观看av网站的网址| 超色免费av| 国产成人免费观看mmmm| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产淫语在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 动漫黄色视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久久久久久久久大奶| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 9热在线视频观看99| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲七黄色美女视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品国产av成人精品| 十八禁高潮呻吟视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 岛国毛片在线播放| 亚洲成国产人片在线观看| 国产在视频线精品| 午夜福利乱码中文字幕| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 桃红色精品国产亚洲av| 最黄视频免费看| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久久精品国产欧美久久久 | 在线 av 中文字幕| 动漫黄色视频在线观看| 97在线人人人人妻| 深夜精品福利| 日本vs欧美在线观看视频| 9191精品国产免费久久| bbb黄色大片| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡| 伊人亚洲综合成人网| 国产激情久久老熟女| 国产精品免费视频内射| 欧美激情 高清一区二区三区| 青草久久国产| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲三区欧美一区| av天堂在线播放| 宅男免费午夜| 国产麻豆69| 午夜福利视频精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲中文av在线| 最黄视频免费看| 国产免费视频播放在线视频| 男人舔女人的私密视频| 欧美激情高清一区二区三区| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美激情在线| 色94色欧美一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲色图综合在线观看| 国产在线观看jvid| 午夜福利在线观看吧| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜福利在线观看吧| 久久综合国产亚洲精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人影院久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲九九香蕉| 久久久久精品国产欧美久久久 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产高清国产精品国产三级| 久久人人97超碰香蕉20202| 99国产综合亚洲精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产精品999| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久热在线av| 日本五十路高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产人伦9x9x在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 在线看a的网站| 男女国产视频网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 黄色视频,在线免费观看| 午夜老司机福利片| 日韩制服骚丝袜av| 岛国毛片在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久av网站| 在线看a的网站| av福利片在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美清纯卡通| 青春草视频在线免费观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产xxxxx性猛交| 久久免费观看电影| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 视频区欧美日本亚洲| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线观看免费视频网站a站| 久久中文字幕一级| 午夜福利在线观看吧| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 男女之事视频高清在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久青草综合色| 国产精品一二三区在线看| 在线观看一区二区三区激情| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 超色免费av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产日韩欧美视频二区| 搡老岳熟女国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲av国产av综合av卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩大码丰满熟妇| www.精华液| 曰老女人黄片| 青春草视频在线免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 18在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品成人在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产91精品成人一区二区三区 | cao死你这个sao货| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美97在线视频| 成人免费观看视频高清| 99热国产这里只有精品6| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99国产精品免费福利视频| 久久九九热精品免费| www.熟女人妻精品国产| 9热在线视频观看99| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美一级毛片孕妇| 在线观看舔阴道视频| 老熟女久久久| 另类亚洲欧美激情| 交换朋友夫妻互换小说| 老司机福利观看| 淫妇啪啪啪对白视频 | 黄色 视频免费看| 日韩电影二区| 国产有黄有色有爽视频| 免费不卡黄色视频| 99久久综合免费| 亚洲精品一区蜜桃| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av男天堂| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 91麻豆精品激情在线观看国产 | 男男h啪啪无遮挡| 欧美日韩亚洲高清精品| 又大又爽又粗| 无限看片的www在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久久久国产电影| 青草久久国产| 欧美精品亚洲一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av国产av综合av卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲精华国产精华精| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品国产av成人精品| 国产在线一区二区三区精| 日本精品一区二区三区蜜桃| 1024视频免费在线观看| 夫妻午夜视频| 秋霞在线观看毛片| 1024香蕉在线观看| 后天国语完整版免费观看| 丁香六月欧美| 国产日韩欧美在线精品| 两人在一起打扑克的视频| 婷婷成人精品国产| 最新的欧美精品一区二区| 无限看片的www在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 嫩草影视91久久| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 一本大道久久a久久精品| 热re99久久精品国产66热6| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 18在线观看网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 亚洲第一青青草原| 黄片大片在线免费观看| 天堂8中文在线网| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 51午夜福利影视在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品在线美女| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲 欧美一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧洲日产国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 777米奇影视久久| 亚洲少妇的诱惑av| 三级毛片av免费| 蜜桃国产av成人99| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产av精品麻豆| 日日夜夜操网爽| 午夜福利,免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 美国免费a级毛片| 视频区图区小说| 一本久久精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品人妻在线不人妻| 欧美激情高清一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最新的欧美精品一区二区| 午夜成年电影在线免费观看| 在线观看www视频免费| 视频区欧美日本亚洲| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 水蜜桃什么品种好| 国产三级黄色录像| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人av激情在线播放| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日本五十路高清| 国产一区二区激情短视频 | 99九九在线精品视频| 亚洲国产看品久久| 黄片大片在线免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 男女之事视频高清在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久网色| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品自拍成人| 久久99热这里只频精品6学生| av天堂在线播放| 亚洲精品自拍成人| 国产免费视频播放在线视频| 久久亚洲精品不卡| 欧美日韩视频精品一区| 免费日韩欧美在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 18禁观看日本| 大型av网站在线播放| 久久青草综合色| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久中文字幕一级| 91老司机精品| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩大码丰满熟妇| 高清欧美精品videossex| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲国产av新网站| a 毛片基地| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人精品无人区| 亚洲精品av麻豆狂野| 一区福利在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品高清国产在线一区| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 人妻人人澡人人爽人人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产伦人伦偷精品视频| 欧美精品av麻豆av| 亚洲 国产 在线| 黄片大片在线免费观看| 国产精品久久久久成人av| 女性生殖器流出的白浆| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品在线美女| 99国产综合亚洲精品| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 成人黄色视频免费在线看| 国产成人a∨麻豆精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 男人操女人黄网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品亚洲成a人片在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 黄色怎么调成土黄色| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 另类亚洲欧美激情| 亚洲人成电影免费在线| 国产在视频线精品| 91精品三级在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 性色av一级| 大型av网站在线播放| 中文字幕av电影在线播放| www.av在线官网国产| 在线观看免费高清a一片| 国产精品一区二区在线观看99| netflix在线观看网站| 国产精品二区激情视频| 不卡一级毛片| netflix在线观看网站| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 成人国产一区最新在线观看| 女人精品久久久久毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 一级毛片电影观看| 久久久久精品人妻al黑| 91精品国产国语对白视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人国产av品久久久| 考比视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲中文av在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩电影二区| 桃花免费在线播放| 美女主播在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜福利一区二区在线看| 精品国产一区二区久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99国产综合亚洲精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久精品免费免费高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美成狂野欧美在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久国内视频| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜老司机福利片| 丝袜喷水一区| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品美女久久av网站| 91九色精品人成在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产精品99久久99久久久不卡| 成人手机av| 黄色 视频免费看| 中文欧美无线码| 亚洲三区欧美一区| 老鸭窝网址在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕av电影在线播放| www.999成人在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 大片电影免费在线观看免费| av在线老鸭窝| 精品国产乱码久久久久久小说| 12—13女人毛片做爰片一| cao死你这个sao货| 咕卡用的链子| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲伊人久久精品综合| 成年av动漫网址| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 大香蕉久久网| 9色porny在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久久久国产电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 满18在线观看网站| 超碰成人久久| 黄色视频,在线免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 国产av一区二区精品久久| 中亚洲国语对白在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 五月开心婷婷网| 中文字幕av电影在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久热在线av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品第一国产精品| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩av久久| 亚洲人成电影免费在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产三级黄色录像| 老司机在亚洲福利影院| 最黄视频免费看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91老司机精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 高清欧美精品videossex| 国产黄色免费在线视频| 成年av动漫网址| 午夜久久久在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 女性被躁到高潮视频| 制服诱惑二区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品在线美女| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利,免费看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久久国内视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产免费现黄频在线看| 一级a爱视频在线免费观看| 精品国产一区二区久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人免费无遮挡视频| 天天操日日干夜夜撸| 成年av动漫网址| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 手机成人av网站| 欧美日韩一级在线毛片| 久热这里只有精品99| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 男女午夜视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 1024视频免费在线观看| 成年av动漫网址| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产av又大| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久热在线av| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲全国av大片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 高清欧美精品videossex| 久久香蕉激情| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 精品第一国产精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品一二三区在线看| 婷婷丁香在线五月| 国产一区二区激情短视频 | 一进一出抽搐动态| 欧美黑人精品巨大| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产黄频视频在线观看| 国产xxxxx性猛交| 亚洲成人手机| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久|