• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究

    2014-05-30 03:56:46馮曉東陳國梁常海飛
    關(guān)鍵詞:駿棗共培養(yǎng)外植體

    馮曉東,陳國梁,喬 璟,常海飛

    (1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 延安 716000)

    棗樹分布于我國北方廣大地區(qū),一般生長在中溫帶與寒帶過渡帶,棗樹也是近年來黃河中下游流域退耕還林和發(fā)展經(jīng)濟(jì)林果的主要樹種之一。隨著棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和市場需求的變化,對棗樹品種及其品質(zhì)特性提出了更多、更高的要求,從而對棗品質(zhì)育種研究提出了新的目標(biāo)。利用基因工程方法建立一個完整、穩(wěn)定的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),不僅可為外源基因的導(dǎo)入奠定技術(shù)基礎(chǔ),還可推動品種的定向改良,縮短育種周期,創(chuàng)造出新的優(yōu)良品種[1]。

    植物基因工程育種的前提是建立一種簡便、快速、有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),以便把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞,進(jìn)而從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株,其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)[2,3]是當(dāng)前棗樹新品種培育研究中不可缺少的技術(shù),可將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后代而無需多代選育,因此具有較大的優(yōu)勢。雖然對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究已經(jīng)進(jìn)行多次改進(jìn),但仍存在一些問題,本試驗(yàn)以駿棗的愈傷組織為外植體,篩選適合駿棗愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基,對其再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了初步研究,為建立一種穩(wěn)妥可靠的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化方法提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    取健壯的繼代培養(yǎng)14 d駿棗(Zizyphus jujubeMill JunZao)無菌愈傷組織,由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院紅棗繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.2 工程農(nóng)桿菌

    工程農(nóng)桿菌菌株(根癌農(nóng)桿菌LBA4404,攜帶pART-GF1-2植物表達(dá)載體),該工程農(nóng)桿菌LBA4404-GF含gbss基因5'側(cè)翼序列及其驅(qū)動的正反向目的片段,其結(jié)構(gòu)如圖1所示:

    圖1 GBSS基因5'側(cè)翼序列驅(qū)動的植物表達(dá)干擾載體的構(gòu)建模式圖

    1.2 方法

    1.2.1 愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

    將同一生長狀態(tài)下的無菌愈傷組織接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行避光培養(yǎng),培養(yǎng)基為MS+6-BA0.4 mg/L+2,4-D1.2 mg/L。選取預(yù)培養(yǎng)6天,繼代14天的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

    1.2.2 工程農(nóng)桿菌的菌懸液制備

    從平板上挑取工程農(nóng)桿菌 LBA4404(含有pART-GF1-2)單菌落,接種于YEP液體培養(yǎng)基中(含 100 mg/LKan、50 mg/LStr),于恒溫 28℃搖床上260 rpm振蕩暗培養(yǎng)24~36 h活化。然后將活化好的菌液按1∶50進(jìn)行放大培養(yǎng),培養(yǎng)6~8 h,待工程菌生長達(dá)到對數(shù)生長期,菌活性最大時,倒入無菌離心管中,5000r/min離心5min,收集的菌體用MS液體培養(yǎng)基稀釋至 OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8 待用。

    1.2.3 卡那霉素選擇壓的確定

    將預(yù)培養(yǎng)后的駿棗無菌愈傷組織分別接種到含Kan 濃度為 0、25、50、75、100、125 mg/L 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每處理各水平外植體25個,每次處理重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度28℃,光周期12/d,光強(qiáng)1500~2000 lx,20 d后統(tǒng)計(jì)駿棗新愈傷組織的產(chǎn)生率。

    1.2.4 愈傷組織的浸染

    切取一定數(shù)量的、生長健壯駿棗無菌愈傷組織,切成0.5 cm左右的小塊,置于工程農(nóng)桿菌菌液(菌液 OD600值分別為 0.2、0.4、0.6、0.8)中浸染,浸染時間依次為5、10、15 min,取出轉(zhuǎn)化材料,用滅菌濾紙拭去其表面菌液,轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,于28℃暗處共培養(yǎng)。

    1.2.5 浸染外植體的脫菌與篩選

    將共培養(yǎng)后外植體轉(zhuǎn)入含250 mg/L頭孢霉素,125 mg/L卡那霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,并在脫菌與抗性篩選的過程中誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

    1.2.6 CTAB 法提取駿棗愈傷組織 DNA[4-6]

    選取抗Kan的愈傷組織0.5 g,用CTAB法提取DNA。

    1.2.7 愈傷組織的PCR檢測[7-8]

    以轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為模板,以pART-GF1-2LBA4404菌液作為陽性對照,未經(jīng)轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為陰性對照,水為空白對照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為800 bp,凝膠電泳瓊脂糖濃度選擇1.2%。

    PCR擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性(94℃,5 min);變性(94℃,50 s),退火(50℃,45 s),延伸(72℃,50 s),循環(huán)30次;最后延伸(72℃,10 min),4℃保存。

    1.2.8 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

    進(jìn)行9個批次的遺傳轉(zhuǎn)化,每個批次均浸染數(shù)十個駿棗外植體,統(tǒng)計(jì)浸染、共培養(yǎng)、脫菌與抗性篩選過程中外植體的損失,最后通過CTAB法提取DNA,并由PCR檢測鑒定目的基因?qū)腧E棗外植體的結(jié)果,計(jì)算遺傳轉(zhuǎn)化率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Kan對駿棗愈傷組織再生的影響

    從表2中可以看出當(dāng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不含Kan時,愈傷組織再生頻率可達(dá)90.5%;含Kan 25~75 mg/L時,愈傷組織再生受到抑制;含125 mg/L以上時,幾乎完全抑制了愈傷組織的再生;更大濃度時,愈傷組織再生率均為零,而且愈傷組織均迅速褐化死亡,以125mg/LKan作為駿棗愈傷組織的篩選濃度。

    2.2 預(yù)培養(yǎng)對愈傷組織再生的影響

    由表3可以看出,預(yù)培養(yǎng)6 d后浸染的駿棗愈傷組織再生頻率高于其他處理,表明駿棗愈傷組織預(yù)培養(yǎng)后浸染要好于未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的,且預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

    表1 Kan對駿棗愈傷組織再生的影響

    表2 受體材料預(yù)培養(yǎng)對愈傷組織再生的影響

    2.3 農(nóng)桿菌液濃度及浸染時間對共培養(yǎng)的影響

    從表可以看出看,雖然菌液濃度及浸染時間對共培養(yǎng)的影響不是很大,但以O(shè)D600為0.4~0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。

    表3 農(nóng)桿菌菌液濃度與浸染時間對共培養(yǎng)的影響

    2.4 駿棗愈傷組織DNA的PCR鑒定結(jié)果

    圖2 以gl-1/gl-6為引物的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

    圖2顯示,浸染過的駿棗愈傷組織1和2出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,且與工程菌質(zhì)粒的擴(kuò)增條帶在同一個水平上,表明工程菌的目的基因已經(jīng)整合至駿棗愈傷組織的DNA中。

    2.5 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    從表5統(tǒng)計(jì)結(jié)果看,經(jīng)PCR檢測到目的基因的愈傷組織僅出現(xiàn)在9個批次的3個批次中。試驗(yàn)中共浸染396個愈傷組織,產(chǎn)生了12個卡那霉素抗性愈傷組織,通過對抗性個體的PCR檢測驗(yàn)證,只有3個將外源基因轉(zhuǎn)移到了植物的基因組中,其最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。

    表4 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

    3 小結(jié)與討論

    建立高效的組織培養(yǎng)和再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)用駿棗愈傷組織作外植體,與農(nóng)桿菌共培養(yǎng),研究了轉(zhuǎn)化過程中影響轉(zhuǎn)化的各種因素,得到了適合駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的適合條件,初步實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化。

    3.1 駿棗愈傷組織對Kan選擇壓的確定

    不同植株對同一種類的抗生素敏感程度不同[9-10],同一種植株的不同器官對同一種類的抗生素敏感程度也不同。試驗(yàn)結(jié)果表明駿棗愈傷組織誘導(dǎo)的新愈傷組織對卡那霉素敏感,合適篩選濃度為125 mg/L。

    3.2 預(yù)培養(yǎng)時間

    預(yù)培養(yǎng)的目的一方面是使外植體盡快適應(yīng)新的生長條件,促進(jìn)細(xì)胞分裂,而分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA,因而可以提高轉(zhuǎn)化效率;另一方面是能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生[11]。棗樹為木本植物是含酚類物質(zhì)較多的一類植物,因此采用預(yù)培養(yǎng)這一步驟則顯得尤為重要。試驗(yàn)表明預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

    3.3 浸染濃度和侵染時間對共培養(yǎng)的影響

    在浸染過程中,菌液濃度和浸染時間是兩個主要參數(shù)。浸染濃度與時間值過小則因外植體上附著的菌體較少而降低農(nóng)桿菌的浸入,浸染濃度與時間值過大則會對外植體造成傷害,且在后續(xù)培養(yǎng)中很難抑制農(nóng)桿菌而引起污染。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌濃度在一定范圍內(nèi),濃度高時適當(dāng)縮短浸染時間,濃度低時適當(dāng)延長浸染時間均可以得到較高的轉(zhuǎn)化率[12]。試驗(yàn)表明菌液濃度和浸染時間對共培養(yǎng)影響不大,但以O(shè)D600為0.4~0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。試驗(yàn)表明,對于駿棗愈傷組織,共培養(yǎng)16d處理后的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。

    最后,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)PCR檢測,在9個批次中得到了2個批次的轉(zhuǎn)基因植株,初步證明外源目的基因已整合到駿棗基因組中。但遺傳轉(zhuǎn)化率較低,最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。至于建立完善的駿棗遺傳轉(zhuǎn)化體系及各參數(shù)的量化分析有待進(jìn)一步的研究。

    [1]何業(yè)華,林良斌,熊興華,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[R].分子植物育種,2003,11(5-6):683-686.

    [2]Xiaoling He,Susan C,Miyasaka,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of taro with a rice chitinase gene for improved tolerance to a fungal pathogen Sclerotium rolfsii[J].Plant Cell Rep,2008,27:903 -909.

    [3]Daxu Li,Qun Sun,Min Huang,et al.Agrobacterium - mediated genetic transformation of Elymus breviaristatus with Pseudomonas pseudoalcaligenes insecticidal protein gene

    [J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2007,89:159 -168.

    [4]謝一青,李志真,黃儒珠,等.光皮樺基因組DNA提取方

    法比較[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào).2006,23(6):664-668.[5]蘇應(yīng)娟,王艇,楊維東,等.羅漢松屬植物DNA的提取和

    RAPD分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,37:13-18.

    [6]黃少甫,趙志芬,陸軍,等.杉木DNA的快速提取[J].林業(yè)科學(xué)研究,1995,8(6):692 -693.

    [7]朱秀志,向成華,彭正松,等.峨眉含笑基因組DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),29(2):46-49.

    [8]劉興菊,湯新彩,梁海永,等.棗樹ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(5):62-65.

    [9]Ningxia Du,Paula M,Pijut.Agrobacterium - mediated transformation of Fraxinus pennsylva nica hypocotyls and plant regeneration[J].Plant Cell Rep,2009,28:915 -923.

    [10]Kyung -Hwan Kim,Yeon -Hee Lee,Donghern Kim,et al.

    Agrobacterium-mediated genetic transfor- mation of Pe

    rilla frutescens[J].Plant Cell Rep,2004,23:386 -390.[11]X.F.Gu,H.Meng,G.Qi,J.R.Zhang.Agrobacterium-mediated transformation of the winter jujube[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2008,94:23 -32.

    [12]尚愛芹,田傳衛(wèi),趙梁軍,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)北海道黃楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(3):409-414.

    猜你喜歡
    駿棗共培養(yǎng)外植體
    阿拉爾墾區(qū)不同樹齡駿棗果實(shí)外觀的比較
    種子科技(2024年3期)2024-03-07 10:52:54
    BMSCs-SCs共培養(yǎng)體系聯(lián)合異種神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究
    不同激素配比對紫花苜蓿幼苗4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響
    山西駿棗和梨棗果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的年動態(tài)變化及其比較
    紫錐菊不定根懸浮共培養(yǎng)中咖啡酸衍生物積累研究
    瀕危植物單性木蘭外植體啟動培養(yǎng)
    解決蘋果矮化砧M9外植體褐化現(xiàn)象的研究
    角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    幾種抗裂劑防治駿棗裂果的效果試驗(yàn)
    噻苯隆與赤霉素在駿棗上配合使用效果初報(bào)
    91精品伊人久久大香线蕉| 黑丝袜美女国产一区| 最新的欧美精品一区二区| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲综合精品二区| 亚洲av不卡在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人精品福利久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产极品天堂在线| 一级a做视频免费观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 91精品国产国语对白视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 人妻 亚洲 视频| 日本黄大片高清| 免费观看a级毛片全部| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 99热网站在线观看| 男人操女人黄网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 午夜日本视频在线| 中文欧美无线码| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品一国产av| 69精品国产乱码久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 我的女老师完整版在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美精品国产亚洲| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品久久久久久av不卡| 涩涩av久久男人的天堂| a级毛片免费高清观看在线播放| a级毛片黄视频| 丝袜喷水一区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 制服丝袜香蕉在线| 午夜久久久在线观看| 热99国产精品久久久久久7| av在线老鸭窝| 美女大奶头黄色视频| 久久久国产一区二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av线在线观看网站| 国产欧美亚洲国产| 国产成人91sexporn| 在线观看免费高清a一片| 中文字幕亚洲精品专区| 九九在线视频观看精品| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美精品一区二区免费开放| 91精品国产国语对白视频| 国产爽快片一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人手机av| 免费大片18禁| 特大巨黑吊av在线直播| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲国产精品专区欧美| 日韩亚洲欧美综合| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人精品无人区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品一区二区三区视频在线| kizo精华| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 97在线人人人人妻| 人体艺术视频欧美日本| 精品久久久久久久久av| 久久精品国产亚洲网站| 十八禁网站网址无遮挡| 国产成人免费观看mmmm| 国产免费视频播放在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品久久久久久精品古装| 纯流量卡能插随身wifi吗| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久99一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 热re99久久精品国产66热6| 欧美人与善性xxx| 一区在线观看完整版| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产成人一精品久久久| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av福利一区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲情色 制服丝袜| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费看光身美女| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲第一av免费看| 大香蕉久久成人网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线观看人妻少妇| 成人毛片a级毛片在线播放| 一级毛片电影观看| 中文字幕免费在线视频6| .国产精品久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 国内精品宾馆在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 视频区图区小说| 午夜老司机福利剧场| 涩涩av久久男人的天堂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 五月开心婷婷网| 99热网站在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产精品一区二区在线观看99| av免费在线看不卡| 人妻系列 视频| 亚洲在久久综合| 最新中文字幕久久久久| 成年人午夜在线观看视频| 蜜桃在线观看..| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 在现免费观看毛片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产成人免费观看mmmm| 欧美精品亚洲一区二区| 国产在线免费精品| 少妇的逼好多水| 丰满饥渴人妻一区二区三| www.av在线官网国产| 色婷婷av一区二区三区视频| 麻豆乱淫一区二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品久久久久久久久av| 超碰97精品在线观看| 亚洲成色77777| 黑人高潮一二区| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品人妻久久久影院| 午夜激情av网站| 麻豆成人av视频| 人人妻人人澡人人看| 亚洲av免费高清在线观看| 18+在线观看网站| 观看av在线不卡| 大片免费播放器 马上看| 少妇精品久久久久久久| 日本午夜av视频| 日韩欧美精品免费久久| 日韩成人伦理影院| 中国三级夫妇交换| 超碰97精品在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 少妇的逼好多水| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产成人精品婷婷| 如何舔出高潮| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利视频在线观看免费| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品久久久久久电影网| 国产精品国产三级国产专区5o| 看十八女毛片水多多多| 九色成人免费人妻av| 婷婷色av中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 视频中文字幕在线观看| 日本91视频免费播放| 日本免费在线观看一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲伊人久久精品综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久久久久精品精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产在线免费精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 97在线人人人人妻| 哪个播放器可以免费观看大片| 2021少妇久久久久久久久久久| kizo精华| 亚洲精品色激情综合| 国产日韩欧美视频二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 在线观看国产h片| 18禁动态无遮挡网站| 久久99一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲美女黄色视频免费看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产伦理片在线播放av一区| 国产亚洲欧美精品永久| 自线自在国产av| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品久久久久成人av| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜日本视频在线| 女性被躁到高潮视频| 国产成人freesex在线| 777米奇影视久久| 久热久热在线精品观看| 91久久精品电影网| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲在久久综合| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲成人一二三区av| 精品熟女少妇av免费看| 午夜福利视频精品| 伦精品一区二区三区| 久久久久视频综合| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品偷伦视频观看了| 精品久久久精品久久久| 亚洲中文av在线| 欧美国产精品一级二级三级| 内地一区二区视频在线| 街头女战士在线观看网站| 国产在视频线精品| 午夜福利,免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲国产成人一精品久久久| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲高清免费不卡视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲内射少妇av| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久午夜欧美精品| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚州av有码| 国产精品久久久久久精品古装| 高清黄色对白视频在线免费看| 一区二区三区四区激情视频| 熟女av电影| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲人成网站在线播| 最新的欧美精品一区二区| 久久国内精品自在自线图片| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费观看性生交大片5| 久久久精品免费免费高清| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品无大码| 成年人午夜在线观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级二级三级毛片免费看| 精品一区二区三卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美日韩av久久| 国产高清不卡午夜福利| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品无大码| 日韩 亚洲 欧美在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产av国产精品国产| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 精品久久久久久电影网| 欧美成人午夜免费资源| 中文欧美无线码| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 国模一区二区三区四区视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产av国产精品国产| 国产精品不卡视频一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 一个人免费看片子| 女人精品久久久久毛片| 国产在线一区二区三区精| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 成人国产av品久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲五月色婷婷综合| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | videos熟女内射| 国产一区有黄有色的免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 边亲边吃奶的免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看人妻少妇| 最黄视频免费看| 人妻系列 视频| 欧美xxⅹ黑人| 久久影院123| 久久久久久久大尺度免费视频| 超色免费av| 国产在视频线精品| 久久久久久久久久成人| 国产成人91sexporn| 国产精品99久久99久久久不卡 | 成人亚洲精品一区在线观看| 一级a做视频免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 插逼视频在线观看| 午夜91福利影院| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久99热这里只频精品6学生| 国产又色又爽无遮挡免| 国产视频首页在线观看| 国产精品人妻久久久久久| √禁漫天堂资源中文www| 国产色婷婷99| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 热re99久久精品国产66热6| 2022亚洲国产成人精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 少妇熟女欧美另类| av在线观看视频网站免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热6这里只有精品| 男女边摸边吃奶| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久久久国产电影| 制服诱惑二区| 18禁动态无遮挡网站| 69精品国产乱码久久久| 高清毛片免费看| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久人妻| 精品久久久久久久久亚洲| 丝袜在线中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 中文字幕亚洲精品专区| av福利片在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 极品人妻少妇av视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 97超视频在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 久久久国产一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 久久人人爽人人爽人人片va| av视频免费观看在线观看| 欧美另类一区| 亚洲性久久影院| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产在线免费精品| 亚洲国产最新在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲精品国产av成人精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品久久久久成人av| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 精品久久久久久久久亚洲| 国产爽快片一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品一区蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av在线老鸭窝| 欧美国产精品一级二级三级| 国产毛片在线视频| 国产av国产精品国产| videosex国产| av不卡在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产极品天堂在线| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲美女视频黄频| 在线观看人妻少妇| 精品久久国产蜜桃| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 男女边摸边吃奶| 麻豆乱淫一区二区| 日韩伦理黄色片| 亚洲国产精品国产精品| 大码成人一级视频| av视频免费观看在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲久久久国产精品| 免费观看性生交大片5| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久精品久久久| 男的添女的下面高潮视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品久久久久久久久亚洲| 老熟女久久久| 久久久国产一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 一区二区三区四区激情视频| 国产有黄有色有爽视频| 水蜜桃什么品种好| 成人黄色视频免费在线看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女国产视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看国产h片| 亚洲国产日韩一区二区| 国模一区二区三区四区视频| 人成视频在线观看免费观看| 夫妻午夜视频| 亚洲国产精品999| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久久久精品性色| 成人手机av| 自线自在国产av| 久久久久视频综合| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久97久久精品| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 中文字幕制服av| 日日撸夜夜添| h视频一区二区三区| 9色porny在线观看| 国产成人精品在线电影| 在现免费观看毛片| 国产精品成人在线| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲色图综合在线观看| 免费观看在线日韩| 99热全是精品| 精品国产一区二区久久| 欧美97在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品.久久久| 一本久久精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品人妻久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲国产色片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久精品人人爽人人爽视色| 精品一区二区三区视频在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 免费av不卡在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| freevideosex欧美| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 最黄视频免费看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品一区在线观看国产| 国产在线免费精品| 国产片特级美女逼逼视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 内地一区二区视频在线| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久av网站| 国产成人a∨麻豆精品| 久久99一区二区三区| 欧美3d第一页| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 另类亚洲欧美激情| 久久 成人 亚洲| 国产免费一级a男人的天堂| 热re99久久精品国产66热6| 国产成人91sexporn| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲色图综合在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 99久久人妻综合| 欧美精品国产亚洲| 精品视频人人做人人爽| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 少妇精品久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费看不卡的av| 黄片播放在线免费| 精品国产露脸久久av麻豆| 少妇熟女欧美另类| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久精品性色| 最新中文字幕久久久久| 日韩电影二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 中文天堂在线官网| 内地一区二区视频在线| 国产精品免费大片| 看十八女毛片水多多多| 午夜激情福利司机影院| 五月伊人婷婷丁香| 在线观看一区二区三区激情| 人人澡人人妻人| 全区人妻精品视频| 成人二区视频| 大片电影免费在线观看免费| 伦理电影大哥的女人| 久久久久精品性色| 少妇人妻 视频| 99久久精品一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 美女大奶头黄色视频| 高清毛片免费看| 国产亚洲最大av| 免费高清在线观看日韩| 少妇熟女欧美另类| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久av网站| 99久国产av精品国产电影| 亚洲天堂av无毛| 日韩视频在线欧美| 国产av国产精品国产| 久久热精品热| 久久精品国产亚洲av天美| 91久久精品国产一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 性色av一级| 在线观看三级黄色| 黄色配什么色好看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久大av| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 日韩制服骚丝袜av| 国产精品人妻久久久久久| 99九九在线精品视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久a久久爽久久v久久| 久久青草综合色| 男的添女的下面高潮视频| 99久久人妻综合| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 热re99久久精品国产66热6| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品第二区| 各种免费的搞黄视频| www.av在线官网国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人免费观看mmmm| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品一区二区免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 老司机影院成人| 又大又黄又爽视频免费| 日韩成人伦理影院| 国产片特级美女逼逼视频| 草草在线视频免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 热99国产精品久久久久久7| 人人妻人人澡人人看| 欧美激情 高清一区二区三区| 在现免费观看毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产日韩欧美视频二区| 在线观看三级黄色| .国产精品久久| 999精品在线视频| 精品久久久久久久久av| 免费高清在线观看日韩| 美女视频免费永久观看网站| 久久久精品94久久精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久久久久久大奶| 丝袜喷水一区|