北京油雞MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)的建立

李金龍, 唐韶青, 鄒智元, 王海潮, 徐青

1. 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院, 北京 100044;

2. 北京市畜牧總站, 北京 100029;

3. 北京交通大學(xué)軟件學(xué)院, 北京 100044

北京油雞MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)的建立

李金龍1, 唐韶青2, 鄒智元3, 王海潮1, 徐青1

1. 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院, 北京 100044;

2. 北京市畜牧總站, 北京 100029;

3. 北京交通大學(xué)軟件學(xué)院, 北京 100044

采用毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù), 對北京油雞肌肉組織基因組進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)檢測。通過對基因組DNA用量、預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、選擇性引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和電泳內(nèi)標(biāo)量等6個主要參數(shù)進(jìn)行分析和優(yōu)化, 建立了適合北京油雞基因組DNA甲基化分析的MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明, 建立的毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記的MSAP檢測技術(shù)能夠自動地、高通量地分析北京油雞基因組的DNA甲基化狀態(tài), 也適用于其他動植物基因組的DNA甲基化研究。

MSAP; 毛細(xì)管電泳; 熒光標(biāo)記; 北京油雞

DNA甲基化是指 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團(tuán)在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)作用下共價結(jié)合到胞嘧啶5'碳原子上的過程[1]。在真核生物中, DNA甲基化主要在基因組CCGG位點(diǎn)以 5-甲基胞嘧啶的形式存在[2], 這些甲基化修飾大部分發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)的重復(fù)序列中,如內(nèi)含子和轉(zhuǎn)座子等[3], DNA甲基化在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和疾病的發(fā)生等方面起著重要的作用[4,5]。

在全基因組水平上對 DNA甲基化進(jìn)行檢測的處理原則包括亞硫酸氫鹽處理和酶切處理等[6], 其中以酶切和PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的MSAP方法敏感性強(qiáng),操作簡單, 適用于沒有任何信息的全基因組范圍CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化水平的分析。MSAP是由擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)經(jīng)過改進(jìn)而來, MSAP利用一組對基因組CCGG位點(diǎn)甲基化敏感性不同的同裂酶 HpaⅡ和 MspⅠ對基因組進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增以及電泳之后產(chǎn)生的差異圖譜來分析樣品的甲基化模式和程度。目前, MSAP方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動植物甲基化相關(guān)的研究中[7,8]。

毛細(xì)管電泳結(jié)合熒光標(biāo)記進(jìn)行片段分析技術(shù)的發(fā)展適應(yīng)于高通量、大規(guī)模檢測數(shù)據(jù)的要求, 能夠?qū)崿F(xiàn)片段分析的自動化, 減少手工分析的錯誤, 是一種快速、準(zhǔn)確、高效率地分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。目前, 毛細(xì)管電泳結(jié)合熒光標(biāo)記在分子標(biāo)記SSR、AFLP以及動物遺傳疾病等全自動分析中取得了較大的進(jìn)展。呂金輝等[9]基于毛細(xì)管電泳技術(shù)建立了適合柳樹的AFLP分析方法。王鳳格等[10]采用毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)通過ABI 3730 xl DNA分析儀進(jìn)行了玉米SSR標(biāo)記的片段分析, 構(gòu)建了玉米標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋數(shù)據(jù)庫。Justyna等[11]比較了不同因素對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響, 并應(yīng)用改進(jìn)的毛細(xì)管電泳技術(shù), 對黑麥草進(jìn)行 AFLP分析。初芹等[12]利用該技術(shù)建立了可同時檢測牛蜘蛛腿綜合征兩個致病位點(diǎn)的方法, 為我國牛群中牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)的篩查工作奠定了基礎(chǔ)。

與 AFLP等分子標(biāo)記的檢測相似, 傳統(tǒng)的MSAP多采用常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染方法來再現(xiàn)擴(kuò)增片段的甲基化狀態(tài), 實(shí)驗(yàn)程序比較復(fù)雜, 費(fèi)時費(fèi)力, 只適用于檢測樣品較少的情況。2005年, 本課題組在傳統(tǒng)的MSAP方法基礎(chǔ)上建立了基于PAGE電泳結(jié)合熒光標(biāo)記的MSAP方法, 并應(yīng)用于雞的DNA甲基化研究[13]。MSAP方法的改進(jìn)解決了傳統(tǒng)銀染分辨率低的問題, 但仍需手動上樣, 且每次最多只可檢測 24個樣品的人工誤差及低通量問題沒有得到較大改善。2011年, 楊春等[14]應(yīng)用結(jié)合測序膠及熒光標(biāo)記的MSAP方法對豬不同組織及不同品種之間DNA甲基化的差異進(jìn)行了檢測。目前,毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記的MSAP在國內(nèi)外的研究中還沒有相關(guān)的報道。本研究以北京油雞為實(shí)驗(yàn)材料,通過對影響酶切、選擇性擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳等反應(yīng)體系中的重要參數(shù)進(jìn)行了詳盡的比較和分析, 建立了適合北京油雞的 MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及基因組提取

選擇17周齡純種北京油雞肌肉組織0.2 g, 應(yīng)用組織基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取基因組 DNA, 結(jié)果于 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測, Biophotometer生物分光光度計(jì)(Eppendorf公司)測定濃度。

1.2 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析

在 MSAP方法中, 使用兩個同裂酶 HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP方法的MseⅠ酶, 通過對樣品進(jìn)行酶切、連接、擴(kuò)增和電泳等實(shí)驗(yàn)步驟來完成樣品的基因組甲基化檢測。其中接頭序列、預(yù)擴(kuò)增引物序列和選擇性引物序列參照徐青[15]方法, 分別取等量的E接頭上下游引物混勻, 依照94℃ 1 min, 65℃ 1 min反應(yīng)完成 E接頭處理過程, H-M接頭做同樣處理。選擇性擴(kuò)增引物采用FAM熒光標(biāo)記, 接頭和引物的序列信息詳見表1。

對于每份油雞基因組 DNA, 同時設(shè)置 MspⅠ/EcoRⅠ和 HpaⅡ/EcoRⅠ兩種酶切反應(yīng)：基因組DNA 450 ng, EcoRⅠ和HpaⅡ各12 U, MspⅠ10 U, 37℃水浴酶切6 h, 65℃滅活15 min; 酶切產(chǎn)物2.5 μL, 按照DNA Ligation Kit (TaKaRa公司)要求, 16℃連接2.5 h, 65℃滅活15 min, 加水稀釋10倍; 稀釋后的產(chǎn)物2 μL, 按94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 72℃ 7 min過程進(jìn)行30個循環(huán)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL, H-M+3引物30 ng, E+3引物5 ng, dNTP Mixture 1.6 μL, MgCl21 μL,Ex Taq酶0.1 μL, 加水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 65℃(-0.7℃/循環(huán)) 30 s, 72℃1 min, 共 13個循環(huán); 之后 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 進(jìn)行23個循環(huán), 最后72℃延伸7 min。限制性內(nèi)切酶購自Promega公司, PCR擴(kuò)增試劑購自TaKaRa公司。

表1 MSAP分析中使用的接頭和引物序列

實(shí)驗(yàn)過程中 MspⅠ/EcoRⅠ和 HpaⅡ/EcoRⅠ兩種酶切反應(yīng)得到結(jié)果無較大差異, 且兩種結(jié)果隨各條件變化趨勢一致, 因此本實(shí)驗(yàn)中提到的結(jié)果為HpaⅡ/EcoRⅠ酶切處理后的結(jié)果, MspⅠ/EcoRⅠ酶切結(jié)果作為驗(yàn)證結(jié)果使用。毛細(xì)管電泳熒光檢測與數(shù)據(jù)分析方法如下：在96孔板的各孔中分別加入3 μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物, 6.67 μL甲酰胺, 0.33 μL ROX 800分子量內(nèi)標(biāo), 95℃變性5 min, 冰上放置10 min,瞬離1 min, 在ABI 3730 xl DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。10 kV預(yù)電泳1 min, 3 kV進(jìn)樣15 s, 10 kV電泳 70 min。收集原始數(shù)據(jù), 系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中的 ROX 800分子量內(nèi)標(biāo)做比較, 通過GeneMapper 4.0軟件對收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)首先對酶切反應(yīng)中的基因組用量進(jìn)行梯度篩選, 在常用的500 ng左右做4個梯度。在選擇性擴(kuò)增反應(yīng)過程中, 分別對預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、選擇性引物濃度、Mg2+濃度和dNTPs濃度設(shè)置檢測梯度, 在毛細(xì)管電泳過程中, 對內(nèi)標(biāo)用量進(jìn)行比較,參數(shù)設(shè)置的詳細(xì)信息及實(shí)驗(yàn)中獲得的主要數(shù)據(jù)結(jié)果見表 2。根據(jù)熒光圖譜中內(nèi)標(biāo)和樣品峰密度、峰高度、雜峰錯峰等情況評價MSAP和毛細(xì)管電泳過程最適反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSAP分析中基因組DNA適宜用量的確定

在 MSAP-毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)中, 基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量對MSAP擴(kuò)增片段的數(shù)量、熒光信號強(qiáng)度及片段峰型都具有較大的影響?；蚪MDNA用量過少或過多都會導(dǎo)致擴(kuò)增片段減少, 而過多的基因組用量還可能影響酶切效率, 最終降低MSAP分析的準(zhǔn)確度。本研究發(fā)現(xiàn)酶切模板量為150和300 ng時, 樣品擴(kuò)增條帶整體峰值較高, 峰密度較均勻, 當(dāng)模板量為450 ng時, 樣品擴(kuò)增片段的數(shù)量及峰值達(dá)到最佳狀態(tài)(圖 1A, 表 2), 而模板量為600 ng時, 樣品擴(kuò)增片段峰值較低, 異常峰型較多,擴(kuò)增片段數(shù)相對較少(圖1B, 表2)。因此, 本文認(rèn)為模板量450 ng為較合適用量。

2.2 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)的確定

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng),本研究比較了預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋5倍、10倍、20倍、50倍后的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋倍數(shù)為5倍時, 500 bp左右的擴(kuò)增片段數(shù)量較少(圖2A, 表 2), 而當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到 20倍以上時, 100～250 bp之間的擴(kuò)增片段數(shù)量較少(圖2C, 表2), 并且峰值普遍較低。相比較而言, 稀釋倍數(shù)為 10倍時,擴(kuò)增條帶分布均勻, 擴(kuò)增峰值熒光信號較強(qiáng), 為較適宜條件(圖2B, 表2)。

2.3 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中引物用量的確定

在選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中, 引物用量是決定擴(kuò)增結(jié)果是否理想的重要因素之一。引物過量會導(dǎo)致樣品的非特異性擴(kuò)增, 反之則會使擴(kuò)增片段數(shù)大量減少。當(dāng)引物用量為實(shí)驗(yàn)設(shè)定的最低值時, 500 bp左右的片段擴(kuò)增效率最高, 而100～245 bp的擴(kuò)增效率最低(圖3A)。隨著引物用量的增加, 500 bp左右的擴(kuò)增條帶數(shù)逐漸減少, 而100～245 bp的片段數(shù)越來越多, 當(dāng)濃度為實(shí)驗(yàn)設(shè)定的最大值時, 100～245 bp的片段超過了所有擴(kuò)增片段總數(shù)的60%(圖3C, 表3)。如圖3B所示,在選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中, 引物終濃度為E(0.25 ng/μL)/ H-M(1.5 ng/μL)時, 產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶大小分布均勻, 擴(kuò)增峰值熒光信號強(qiáng)度適中, 為較理想的擴(kuò)增條件。

表2 MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測分析中各參數(shù)的設(shè)置及獲得的MSAP擴(kuò)增片段數(shù)

圖1 不同基因組DNA用量的熒光圖譜A：450 ng; B：600 ng。

2.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中Mg2+濃度的確定

在選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中, 鎂離子濃度可影響聚合酶活性及擴(kuò)增片段特異性, 本文設(shè)置了 0.625 mmol/L、1 mmol/L、1.25 mmol/L、1.5 mmol/L等4個濃度梯度。電泳結(jié)果顯示, 當(dāng)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系中的Mg2+濃度為0.625 mmol/L時, 擴(kuò)增條帶的數(shù)量較少, 峰值較低, 隨著 Mg2+濃度的增加, 擴(kuò)增條帶的數(shù)量和峰值均顯著提高。但是, 當(dāng) Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(圖4B), 毛細(xì)管電泳熒光檢測中的內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)了較嚴(yán)重的亂峰現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中, 1.25 mmol/L 的Mg2+濃度為較適的反應(yīng)條件(圖4A)。

2.5 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中dNTPs濃度的確定

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中, dNTPs濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響是很明顯的, 當(dāng)dNTPs濃度為0.15 mmol/L時,樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰均能滿足實(shí)驗(yàn)要求, 當(dāng)dNTPs濃度增加到0.2 mmol/L時, 擴(kuò)增條帶開始減少, 尤其是大片段減少非常明顯, 繼續(xù)增加dNTPs濃度至0.25 mmol/L及以上時, 擴(kuò)增條帶數(shù)僅為圖5A的50%左右(圖5B, 表2), 所以, 當(dāng)dNTPs濃度為0.15 mmol/L時, 大片段能有效擴(kuò)增且整體擴(kuò)增結(jié)果是最理想的,因此將實(shí)驗(yàn)中dNTPs濃度定為0.15 mmol/L。

表3 不同引物濃度獲得的選擇性擴(kuò)增片段結(jié)果

2.6 毛細(xì)管電泳中內(nèi)標(biāo)用量的確定

在毛細(xì)管電泳中, 每個樣品孔內(nèi)均含有內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)使用量較大。標(biāo)準(zhǔn)的毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)的使用量為每孔5 μL, 本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)標(biāo)使用量5 μL和2.5 μL進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 內(nèi)標(biāo)量減半時的結(jié)果與正常內(nèi)標(biāo)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著差別(圖 6, 表 2), 所以使用2.5 μL的內(nèi)標(biāo)量可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

3 討 論

相對于傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測分析, 毛細(xì)管電泳熒光檢測 MSAP技術(shù)省去了凝膠配制、手動上樣及銀染等繁瑣步驟, 提高了檢測效率, 較大地減少了手動操作中的人為誤差, 增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性, 而且可對96個樣品進(jìn)行同時檢測, 滿足了大量樣品檢測的高通量需要[16]。毛細(xì)管電泳熒光檢測MSAP不但包括與傳統(tǒng)的MSAP同樣的酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增等過程, 而且包括毛細(xì)管電泳熒光檢測特有的內(nèi)標(biāo)使用、進(jìn)樣時間和熒光檢測等過程, 每個過程每個小的反應(yīng)參數(shù)都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生或大或小的影響。本實(shí)驗(yàn)以北京油雞肌肉組織為材料, 通過對基因組DNA用量、PCR模板量、引物濃度等6個重要參數(shù)進(jìn)行了不同設(shè)置值的比較, 并根據(jù)熒光圖譜中內(nèi)標(biāo)和樣品峰密度、峰高度、雜峰錯峰等數(shù)據(jù)來確定了適合本研究的最適反應(yīng)條件, 成功建立了毛細(xì)管電泳熒光檢測 MSAP技術(shù)體系, 為北京油雞的全基因組 DNA甲基化分析提供了完善的技術(shù)分析平臺, 經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)論證, 本文所建立和優(yōu)化后的體系具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。另外, 本研究也對不同DNA聚合酶對擴(kuò)增結(jié)果的影響, 毛細(xì)管電泳相關(guān)的不同上樣量及不同預(yù)電泳時間對結(jié)果的影響進(jìn)行了比較, 在本文中, 沒有發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)對結(jié)果具有顯著的影響, 或者可通過其他參數(shù)來控制這些條件, 所以本文沒有顯示這幾個參數(shù)的比較結(jié)果,如需要相關(guān)的數(shù)據(jù), 請聯(lián)系本文的通訊作者。

圖4 Mg2+濃度對選擇性擴(kuò)增結(jié)果的影響A：Mg2+濃度為1.25 mmol/L時樣品峰及內(nèi)標(biāo)峰; B：Mg2+濃度為1.5 mmol/L時樣品峰及內(nèi)標(biāo)峰。

圖5 dNTPs濃度對選擇性擴(kuò)增結(jié)果的影響A：0.15 mmol/L; B：0.2 mmol/L。

圖6 內(nèi)標(biāo)上樣量對電泳結(jié)果的影響A：2.5 μL內(nèi)標(biāo)時樣品峰及內(nèi)標(biāo)峰; B：5 μL內(nèi)標(biāo)時樣品峰及內(nèi)標(biāo)峰。

在選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)等參數(shù)對擴(kuò)增結(jié)果都有影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)引物濃度和dNTPs濃度是選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵因素, 尤其是引物濃度, 較低的引物濃度有利于較長片段的擴(kuò)增, 這在其他研究也有相關(guān)報道[17]。隨著引物濃度的增加, 樣品長片段數(shù)量減少, 小片段數(shù)量逐漸增加。因此, 在應(yīng)用MSAP方法進(jìn)行基因組DNA甲基化分析時, 研究人員可根據(jù)自已的研究目地調(diào)整引物濃度獲得自已感興趣的擴(kuò)增片段。而在毛細(xì)管電泳過程中, 每個孔道內(nèi)均含有內(nèi)標(biāo)和樣品, 在進(jìn)樣時, 樣品、內(nèi)標(biāo)及雜質(zhì)之間, 同一樣品的不同片段之間均為競爭關(guān)系。本研究結(jié)果顯示基因組 DNA的用量通過間接影響選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果來影響熒光檢測圖譜的內(nèi)標(biāo)峰值、峰型和樣品峰峰值。但對于相同的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物, 上樣量越低, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的雜質(zhì)含量也就趆少, 雖然樣品峰值較低, 但由于缺少進(jìn)樣競爭內(nèi)標(biāo)峰值相對較高。另外, 相對于長片段來說, 小片段是優(yōu)先進(jìn)樣的, 上樣量過高會導(dǎo)致小片段區(qū)的峰值過高, 而過高的樣品峰值會拉起內(nèi)標(biāo)峰,使內(nèi)標(biāo)峰在小片段區(qū)域產(chǎn)生雜峰, 影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以使用合適的基因組DNA量作為模板, 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屖潜ＷC選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物最適宜上樣量的兩個重要條件。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)在毛細(xì)管電泳中, 將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)使用量減半時, 結(jié)果未受到影響, 因些, 在實(shí)驗(yàn)過程中可以減少內(nèi)標(biāo)用量, 節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

本文沒有對酶切時間和PCR程序等進(jìn)行比較和分析, 因?yàn)檫@些條件相對穩(wěn)定[18], 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。雖然本文對影響毛細(xì)管電泳熒光檢測 MSAP技術(shù)的多種因素進(jìn)行了詳細(xì)的分析和比較, 確定了適合北京油雞基因組甲基化檢測的條件。但在實(shí)驗(yàn)中, 因?yàn)闄z測的樣品不同, 所用的儀器不同, 所用的試劑不同, 研究人員的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣不同等因素都會影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 所以每位科研人員應(yīng)根據(jù)自已的研究目地和研究條件, 參照本實(shí)驗(yàn)確定的適宜條件,進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn), 最后確定適合自已的參數(shù)值。表 4中是對毛細(xì)管電泳過程中的一些常見問題及解決方法進(jìn)行的總結(jié), 供大家參考。

表4 毛細(xì)管電泳過程中常見問題及解決方法

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(責(zé)任編委: 李輝)

Establishment of fluorescence labeling and capillary electrophoresis in MSAP for Beijing You chicken

Jinlong Li1, Shaoqing Tang2, Zhiyuan Zou3, Haichao Wang1, Qing Xu1

1. Institute of Life Science and Biotechnology, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China;
2. Beijing Animal Husbandry Station, Beijing 100029, China;
3. Institute of Software, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China

The DNA methylated states in muscle tissues from Beijing You chicken were analyzed using methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP) combined with fluorescence labeling and capillary electrophoresis technology. We optimized the MSAP experimental condition including the genomic DNA concentration, dilution of pre-amplification product, the internal standard content and the concentrations of selective primers, Mg2+and dNTPs. Repeated experiments showed that this method can automatically detect the global DNA methylation states in Beijing You chicken, and can be extended to other animals or plants with complex genomes and rich methylation polymorphism.

methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP); capillary electrophoresis; fluorescence labeling; Beijing You chicken

2013-09-29;

2013-12-09

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號：31101711), 北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：6112018)和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(編號：2012JBZ003)資助

李金龍, 碩士研究生, 專業(yè)方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: lijinlong880827@163.com

徐青, 博士, 副教授, 研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: qingxu@bjtu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0495

時間: 2014-1-22 10:41:22

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140122.1041.001.html