巰基化阿霉素的兩種合成方法的比較

·論著·

巰基化阿霉素的兩種合成方法的比較

吳珊1，張葉葉1，郭海霞2，劉俊杰1，孫治國1，鐘延強(qiáng)1，鄒豪1(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，上海 200433; 2.解放軍266醫(yī)院，河北承德 067000)

目的探索合成供金納米粒載藥系統(tǒng)研究用模型藥物巰基化阿霉素的可行方法。方法 分別采用2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-IT)法和琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)法合成巰基阿霉素，通過高效液相色譜(HPLC)、飛行時(shí)間質(zhì)譜(MS-ESI)及核磁共振氫譜(1H NMR)驗(yàn)證巰基阿霉素的合成，并考察反應(yīng)物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間等因素對合成巰基阿霉素的影響。結(jié)果1 H NMR確證DOX-SATA出現(xiàn)了與硫酯基團(tuán)相連的質(zhì)子信號，表明新合成的化合物中含有硫酯基團(tuán)。HPLC及MS-ESI結(jié)果顯示，兩種方法均能合成巰基阿霉素，2-IT法生成的巰基阿霉素，隨著反應(yīng)時(shí)間延長易發(fā)生環(huán)化，形成環(huán)化巰基阿霉素。SATA試劑法合成巰基阿霉素過程中不易發(fā)生副反應(yīng)，合成的巰基阿霉素較為穩(wěn)定。結(jié)論 通過兩種方法的比較，SATA法合成巰基阿霉素的方法較為可行。

巰基化阿霉素;2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-IT);琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)

阿霉素(DOX)為放線菌(Streptomyces varcaesius)產(chǎn)生的蒽環(huán)類抗生素，是一種作用于DNA的藥物，抗菌譜廣，對多種腫瘤都有作用，廣泛用于化學(xué)治療。但長期使用阿霉素產(chǎn)生的蓄積性心臟毒性和腫瘤細(xì)胞對阿霉素產(chǎn)生的多藥耐藥性限制了阿霉素在臨床上的應(yīng)用［1］。

納米載藥系統(tǒng)具有增強(qiáng)腫瘤的EPR效應(yīng)、減少游離藥物的非特異毒性及延長藥物的體循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)藥物在作用部位的蓄積，提高藥效等優(yōu)點(diǎn)而成為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的有效逆轉(zhuǎn)策略之一［2］。近年來基于阿霉素的納米載藥系統(tǒng)主要包括阿霉素脂質(zhì)體［3］、阿霉素膠束［4］、阿霉素聚合物納米粒［5］等，其中，以Au-S鍵為基礎(chǔ)的谷胱甘肽還原響應(yīng)型納米載藥系統(tǒng)［6］成為研究熱點(diǎn)。

為使阿霉素能與金納米粒通過Au-S鍵形成金納米粒載藥系統(tǒng)，首先需要對游離的阿霉素進(jìn)行化學(xué)修飾，合成具有含有游離巰基的巰基阿霉素(DOX-SH)。本研究采用兩種不同方法合成了模型藥物DOX-SH，并通過高效液相色譜(HPLC)、飛行時(shí)間質(zhì)譜(MS-ESI)及核磁共振氫譜(1H NMR)比較了這兩種方法的可行性，為進(jìn)一步構(gòu)建金納米粒載藥系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料鹽酸阿霉素(DOX·HCl)(大連美侖生物技術(shù)有限公司);2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-IT)、琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?SATA)(美國Sigma公司);N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺(TEA)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、氯化鈉(NaCl)、鹽酸羥胺(NH2OH·HCl)、碳酸鈉(Na2CO3)(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三氟乙酸(TFA)(美國Tedia公司);乙腈、甲醇均為色譜純(德國默克公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器85-2恒溫磁力攪拌器(中國國華電器有限公司)，Nanopure DiamondTM純水機(jī)(美國Barnstead公司)，AL104電子天平［METTLER TOLEDO儀器(上海)有限公司］，分液漏斗(上海和器公司)，濃縮儀(德國Eppendorf公司)，高效液相色譜儀LC-20A(日本島津公司SHIMADZU)，十萬分之一天平［METTLER TOLEDO儀器(上海)有限公司］，超聲波清洗器SK 3300LH(上海市科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，核磁共振儀Avane II 600 MHz(瑞士Bruker公司)，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀G6220A TOF(美國Agilent Technologies)。

2 方法

2.1 2-IT試劑法合成DOX-SH［7］

2.1.1 制備方法精密稱取DOX·HCl和2-IT按1∶10、1∶20、1∶30的摩爾比混合后溶于適量甲醇中，加入適量三乙胺，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為8～10，在N2保護(hù)避光的條件下，室溫?cái)嚢? h或24 h后，純化干燥得到DOX-SH。

將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC色譜分析，考察不同反應(yīng)物摩爾比及不同反應(yīng)時(shí)間對DOX-SH合成的影響。

2.1.2 HPLC檢測DOX-SH色譜條件色譜柱: ODS色譜柱;柱溫:30°C;流動(dòng)相:乙腈和水(0.2% TFA)(35∶65，V/V);流速:1.0 ml/min;紫外檢測波長:490 nm;進(jìn)樣量:20μl;保留時(shí)間:20 min。

2.1.3 不同反應(yīng)摩爾比對DOX-SH的合成影響反應(yīng)摩爾比是影響反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一，本研究考察DOX·HCl與2-IT摩爾比分別為1∶10、1∶20、1∶30對合成DOX-SH的影響，反應(yīng)時(shí)間為2 h，計(jì)算不同反應(yīng)摩爾比阿霉素的轉(zhuǎn)化率。

2.1.4 不同反應(yīng)時(shí)間對DOX-SH的合成影響根據(jù)“2.1.3”確定的最優(yōu)反應(yīng)摩爾比按照“2.1.1”的反應(yīng)流程進(jìn)行反應(yīng)，分別在2 h和24 h對產(chǎn)物進(jìn)行HPLC色譜分析，考察不同反應(yīng)時(shí)間對DOX-SH合成的影響。

2.2 SATA試劑法合成DOX-SH

2.2.1 制備方法［8］精密稱取10.5mg DOX·HCl和25.2mg SATA于10ml試管中，用3ml DMF溶解，加入6μl三乙胺于磁力攪拌器上攪拌3 h得到乙酰硫代乙酸酯取代的阿霉素(DOX-SATA)，反應(yīng)后的溶液用5ml水稀釋，分別用8、7ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并乙酸乙酯層，依次用1%鹽酸、飽和碳酸鈉、飽和食鹽水洗滌3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到第一步反應(yīng)產(chǎn)物DOX-SATA。取純化后的DOX-SATA適量溶于DMF中，加入3.4mg 0.5mol/L鹽酸羥胺、2μl三乙胺繼續(xù)反應(yīng)1 h后，純化干燥得到DOX-SH。

2.2.2 HPLC驗(yàn)證不同時(shí)間各步反應(yīng)產(chǎn)物及產(chǎn)物穩(wěn)定性取“2.2.1”中反應(yīng)生成的第一步產(chǎn)物DOX-SATA及終產(chǎn)物DOX-SH分別溶于流動(dòng)相后，HPLC分析各步產(chǎn)物。將制備的DOX-SATA和DOX-SH室溫放置24 h后，HPLC分析各產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

2.3 飛行時(shí)間質(zhì)譜MS-ESI驗(yàn)證DOX-SH的合成將“2.1”及“2.2”中制得的DOX-SH分別溶于甲醇，于飛行時(shí)間質(zhì)譜儀G6220A TOF進(jìn)行測定，檢測兩種方法合成的DOX-SH的分子量。

質(zhì)譜條件:檢測模式為負(fù)離子模式;霧化器壓力0.34 MPa;毛細(xì)管電壓3 600 V;碎片器電壓120 V;氮?dú)饬髁?0 L/min;氮?dú)鉁囟?00.0°C。

2.4 核磁共振氫譜(1H NMR)驗(yàn)證DOX-SATA的合成稱取10 mg DOX、DOX-SATA粉末，分別溶于MeOD-d4，用600 MHz核磁共振儀(AvaneⅡ600 MHz，Bruker)鑒定化合物的分子結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 2-IT試劑法合成DOX-SH2-IT試劑法合成DOX-SH的反應(yīng)機(jī)制如圖1所示，2-IT為伯胺的硫醇化試劑，DOX上的伯胺與2-IT試劑反應(yīng)初期快速形成含有游離巰基和不穩(wěn)定的亞氨基的DOX-SH，但是DOX-SH在pH值為7.8的條件下，分子內(nèi)部的亞氨基極易與游離巰基的氫原子結(jié)合脫去氨氣，形成環(huán)化巰基阿霉素(cyc-DOX)。

3.1.1 不同反應(yīng)摩爾比對合成DOX-SH的影響用2-IT試劑法合成DOX-SH，其合成的轉(zhuǎn)化率受到反應(yīng)物的摩爾比的影響。圖2A中DOX的保留時(shí)間為7.1 min，圖2B～2D中3份色譜圖均出現(xiàn)了保留時(shí)間分別為12.7 min的DOX-SH和10.6 min的cyc-DOX的色譜峰。由圖可知，增大反應(yīng)摩爾比，DOX-SH和cyc-DOX的色譜峰峰面積增大，表明增大反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾比，DOX-SH的產(chǎn)率增加。圖2D表示，DOX與2-IT試劑反應(yīng)2 h，DOX基本反應(yīng)完全。以DOX的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A= 14 587C-15 620(r=0.999 6)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到不同反應(yīng)摩爾比DOX的轉(zhuǎn)化率如表1所示。

圖1 2-IT試劑法合成DOX-SH反應(yīng)機(jī)制

圖2 不同反應(yīng)摩爾比合成DOX-SH的HPLC色譜圖

表1 2-IT試劑法合成DOX-SH不同反應(yīng)摩爾比DOX的轉(zhuǎn)化率

3.1.2 不同反應(yīng)時(shí)間對合成DOX-SH的影響本研究進(jìn)一步利用HPLC法考察了不同反應(yīng)時(shí)間對DOX-SH合成的影響。圖3A、圖3B為DOX與2-IT試劑反應(yīng)2 h和24 h后的DOX-SH色譜圖，圖3B與圖3A相比，DOX的色譜峰峰面積減小，甚至消失，表明反應(yīng)時(shí)間延長，DOX反應(yīng)完全。但是與此同時(shí)，DOX-SH色譜峰也消失，表明該DOX-SH不穩(wěn)定，cyc-DOX明顯增加。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間合成DOX-SH的HPLC色譜圖A(2 h)、B(24 h)

3.2 SATA試劑法合成DOX-SH

3.2.1 HPLC色譜分析合成DOX-SH各步反應(yīng)產(chǎn)物合成DOX-SH也可采用雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑SATA試劑法，該方法合成DOX-SH的反應(yīng)機(jī)制如圖4所示。琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯SATA與伯胺反應(yīng)添加保護(hù)性巰基。DOX的伯胺和SATA上琥珀酰亞胺在一定摩爾比下反應(yīng)生成中間產(chǎn)物DOXSATA，DOX-SATA的乙酰基硫代乙酸酯在鹽酸羥胺的作用下脫去乙?；鶊F(tuán)，最終在DOX分子上引入游離巰基基團(tuán)。

圖4 SATA試劑法合成DOX-SH的反應(yīng)流程圖

將該方法合成DOX-SH過程中的各部分產(chǎn)物按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析。圖5A保留時(shí)間為6.4 min，反應(yīng)3 h后生成的DOX-SATA的保留時(shí)間為14.8 min(圖5B)，經(jīng)鹽酸羥胺脫去乙?；鶊F(tuán)后生成DOX-SH的色譜圖如圖5C所示，保留時(shí)間改變?yōu)?.9 min。

圖5 SATA試劑法合成DOX-SH的各步反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC色譜圖

3.2.2 HPLC驗(yàn)證DOX-SATA及DOX-SH的穩(wěn)定性

SATA試劑法合成DOX-SH各步反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性如圖6所示，從圖6A可以看出，放置24 h后 DOX-SATA的保留時(shí)間(15.26 min)變化不大，表明DOX-SATA比較穩(wěn)定。與反應(yīng)初生成的DOX-SH相比，也并未發(fā)生明顯變化，表明該方法合成的DOX-SH較為穩(wěn)定(圖6B)。

3.3 MS-ESI驗(yàn)證兩種方法DOX-SH的合成通過MS-ESI考察了兩種合成DOX-SH的分子量，圖7A為未發(fā)生反應(yīng)的DOX的質(zhì)譜圖，阿霉素的分子離子峰為544.18，經(jīng)2-IT試劑法巰基化之后的DOX-SH的分子離子峰為645.21(圖7B)，分子量為628.18的分子離子峰與化合物的相對摩爾質(zhì)量645.21相比，分子量減少了17，結(jié)合“3.1.1”中2-IT試劑與阿霉素反應(yīng)的機(jī)制可知，628.18為cyc-DOX的分子離子峰，該結(jié)果與HPLC色譜圖結(jié)果一致。SATA試劑法合成的DOX-SH如圖7C所示，分子離子峰為616.15，兩種方法合成的DOXSH的分子量均與理論值相符，表明兩法均能成功合成DOX-SH。

圖6 SATA試劑法合成DOX-SH各步反應(yīng)產(chǎn)物放置24 h后的穩(wěn)定性1.DOX-SATA;2.DOX-SH

圖7 DOX(A)、DOX-SH(B，2-IT試劑法)、DOX-SH(C，SATA試劑法)的MS-ESI譜圖

3.41H NMR驗(yàn)證DOX-SATA的合成采用600 M1H NMR和HPLC法對DOX的巰基化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。如圖8所示，與DOX相比，DOX-SATA出現(xiàn)了與硫酯基團(tuán)相連的質(zhì)子信號，表明新合成的化合物中含有硫酯基團(tuán)。

圖8 DOX(A)、DOX-SATA(B)的600 M1H NMR譜圖

4 討論

阿霉素分子結(jié)構(gòu)中具有活性氨基，較易與其他試劑形成共價(jià)鍵從而被修飾成具有特定官能團(tuán)的阿霉素衍生物，并且被修飾的阿霉素抗腫瘤活性沒有明顯改變。本研究探索了對阿霉素進(jìn)行巰基化修飾的兩種化學(xué)合成方法，通過HPLC和MS-ESI等手段對合成的巰基阿霉素進(jìn)行表征和鑒定。

1H NMR確證DOX-SATA出現(xiàn)了與硫酯基團(tuán)相連的質(zhì)子信號，表明新合成的化合物中含有硫酯基團(tuán)。HPLC和MS-ESI結(jié)果顯示，兩種方法均能合成巰基阿霉素。然而，2-IT試劑法中，由于接枝到阿霉素游離氨基上的2-IT試劑中含有活性較大的亞胺基，亞胺基極易與反應(yīng)初始階段形成的游離巰基上的氫結(jié)合形成氨氣，而母環(huán)最終形成環(huán)化巰基阿霉素。因此，該方法合成的巰基阿霉素不穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長巰基阿霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)化巰基阿霉素，不能滿足用作模型藥物的游離巰基的要求。SATA試劑法合成巰基阿霉素的反應(yīng)過程中，首先形成穩(wěn)定的乙酰硫代乙酸酯取代的阿霉素，然后再在鹽酸羥胺的作用下脫去乙酰基團(tuán)，形成含有游離巰基的巰基阿霉素，該過程中不存在其他易發(fā)生的副反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，SATA試劑法合成含有游離巰基的巰基阿霉素的方法更為可行。

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A com parison study of synthesizing methods of thiolated doxorubicin

WU Shan1，ZHANG Yeye1，GUO Haixia2，LIU Junjie1，SUN Zhiguo1，ZHONG Yanqiang1，ZOU Hao1(1.Departmentof Pharmaceutics，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China;2.NO.266 Hospital of PLA，Chengde 067000，China)

Objective Toinvestigate the optimalmethod for synthesizing thiolated doxorubicin.MethodsThiolated doxorubicin was synthesized through two differentmethods.Doxorubicin was reacted with 2-iminothiolane(2-IT)and S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide ester(SATA)，respectively.The synthesized thiolated doxorubicin was further characterized by HPLC and MSESI techniques.Several factors includingmolar ratios aswell as reaction timewere evaluated.ResultsThe results showed that thiolated doxorubicin could be synthesized via both of the twomethods successfully.Thiolated doxorubicin could be stable when doxorubicin was reacted with SATA.But the crude thiolated doxorubicin could be cyclized easily when doxorubicin was reacted with 2-IT.ConclusionThiolated doxorubicin prepared with SATA ismore feasible than thatwith 2-IT.

thiolated doxorubicin;2-iminothiolane(2-IT);S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide ester(SATA)

O621.3 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號］1006-0111(2014)06-0428-06

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.008

2014-08-02

2014-10-13［本文編輯］李睿旻

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30801441);科技部重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)(2014ZX09J14107-01B).

吳珊，碩士.Tel:13817291343，E-mail:wushan_1012@ 163.com.

鄒豪，副教授.Tel:(021)81871287;E-mail:haozou@ smmu.edu.cn.