大腸癌圍手術(shù)期氣虛證與陰虛證患者基因差異表達(dá)圖譜研究

洪朝金郭 勇（指導(dǎo)）

1浙江省人民醫(yī)院腫瘤科 杭州 310014 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310006

·論 著·

大腸癌圍手術(shù)期氣虛證與陰虛證患者基因差異表達(dá)圖譜研究

洪朝金1郭 勇2（指導(dǎo)）

1浙江省人民醫(yī)院腫瘤科 杭州 310014 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310006

目的 研究大腸癌圍手術(shù)期氣虛證與陰虛證患者的特征性基因差異表達(dá)譜。方法 大腸癌手術(shù)患者8例，以圍手術(shù)期中醫(yī)辨證，氣虛證4例（氣虛證組），陰虛證4例（陰虛證組），采集8例患者大腸癌組織及瘤周正常組織，采用含有45 033個(gè)己知基因的人全基因組芯片技術(shù)檢測(cè)大腸組織內(nèi)差異基因表達(dá)情況，比較各組的差異表達(dá)基因，利用生物分子功能注釋系統(tǒng)GO和pathway對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 大腸癌圍手術(shù)期氣虛證瘤體組和瘤周正常組差異表達(dá)基因共5044條，表達(dá)水平上調(diào)3400條,下調(diào)1644條；氣虛證瘤體組與陰虛證瘤體組差異表達(dá)基因共1335條，表達(dá)水平上調(diào)547條，下調(diào)788條。經(jīng)檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。結(jié)論 大腸癌圍手術(shù)期氣虛證組與瘤周正常組比較，存在的組織基因差異表達(dá)特征圖譜，主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、血管平滑肌收縮、嘌呤嘧啶代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、DNA復(fù)制等基因相關(guān)；氣虛證組與陰虛證組瘤體比較，也存在組織基因差異表達(dá)特征圖譜，主要是與炎癥、免疫應(yīng)答、礦物質(zhì)吸收、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞黏附、遺傳信息過(guò)程、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、氮代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等基因相關(guān)。

大腸癌圍手術(shù)期；氣虛證；陰虛證；基因差異表達(dá)；基因芯片

KEY WORDSperioperative period of colorectal carcinoma；Qi deficiency syndrome；Yin deficiency syndrome；genes differently expressed map gene chips

基因組學(xué)從整體上研究基因的功能，這與中醫(yī)學(xué)的“整體觀”概念十分相似。基因芯片是隨著人類基因組研究的深入而迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的生物學(xué)技術(shù)，它的特點(diǎn)是高通量、快速、并行化采集生物信息。借助基因芯片這種先進(jìn)、快速的研究手段，可以嘗試從基因水平探討大腸癌圍手術(shù)期證候的本質(zhì)，通過(guò)對(duì)同病異證基因表達(dá)譜差異比較中尋找證候的差異性，建立“證候-基因表達(dá)譜”，揭示證與基因的內(nèi)在聯(lián)系。證候研究是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的核心內(nèi)容。筆者對(duì)大腸癌圍手術(shù)期氣虛證與陰虛證患者的特征性基因差異表達(dá)譜進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIZOL試劑 （Invitrogen life technologies）；Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen，11917-020）；NimbleGen單色DNA標(biāo)記試劑盒；NimbleGen芯片雜交系統(tǒng)(Nimblegen，05223679001）；NimbleGen芯片雜交試劑盒（Nimblegen，05223474001）；NimbleGen HX12 mixer（Nimblegen，05223768001）；NimbleGen洗滌緩沖試劑盒（Nimblegen，05223504001）

1.2 儀器及設(shè)備 Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀（Corbett Research公司）；引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0）；Rotor-gene 6.0（Corbett Research公 司）；GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）；GenePix 4000B（Axon）；GenePix pro V6.0。

1.3 病例來(lái)源 2011年8月—2011年10月共收集大腸癌圍手術(shù)期患者8例，均來(lái)源于浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院。其中男4例，女4例，年齡48～68歲；結(jié)腸癌4例，直腸癌4例；術(shù)前均經(jīng)腸鏡明確診斷，術(shù)后病理證實(shí)；氣虛證與陰虛證患者各4例。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn) 大腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》2011版。臨床分期使用AJCC（2007年版）制定的TNM分期。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《GB/T 16751.2-1997中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)證候部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB）》進(jìn)行。氣虛證:主證:①氣短乏力；②神疲懶言；③舌淡；④脈虛細(xì)無(wú)力。次證：①頭暈眼花；②飲食減少；③自汗。具備主證三項(xiàng)、次證一項(xiàng)者即為氣虛證。陰虛證：主證：①五心煩熱；②咽燥口干渴；③舌紅或少苔、無(wú)苔；④脈細(xì)數(shù)。次證:①潮熱；②便結(jié)而尿短赤；③盜汗。具備主證三項(xiàng)、次證一項(xiàng)者即為陰虛證。

1.5 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①有細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)依據(jù)；②大腸癌圍手術(shù)期；③年齡50～70歲；④調(diào)查時(shí)能良好配合；⑤中醫(yī)辨證氣虛型或陰虛證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷不明確；②調(diào)查時(shí)合并有其他疾病，并以其他疾病為突出表現(xiàn)，影響大腸癌證候辨證者；③合并有嚴(yán)重的心、肺、腦、肝、腎、糖尿病等重大疾病者；④不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或臨床資料不全者；⑤既往有惡性腫瘤史者；⑥精神病患者以及神志不清，無(wú)法語(yǔ)言交流者。

2 方 法

2.1 大腸癌組織采集 經(jīng)腸鏡下診斷符合納入標(biāo)準(zhǔn)后，經(jīng)手術(shù)室切取4例氣虛證患者大腸癌組織及瘤旁正常組織各1塊，4例陰虛證患者癌組織各1塊。生理鹽水清洗后，氣虛證癌組織、瘤旁正常組織及陰虛證患者癌組織各取一塊置于10%福爾馬林液中備做病理切片HE染色檢查，其余于置于RNAlater中，置凍存管中迅速投入液氮，以防止大腸癌組織內(nèi)部的RNA降解。備基因芯片研究。

2.2 RNA提取和質(zhì)量控制 采用Trizol及其方法抽提總RNA，12個(gè)組織樣本RNA合并并混勻；采用NanoDrop ND-1000測(cè)定 RNA在分光光度計(jì)280nm、260nm、230nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度，用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。樣本的吸光度A260與A280比值在1.95～2.05之間，電泳RNA的28S和18S條帶清晰，28S條帶約是18S條帶的2倍為質(zhì)量合格。

2.3 熒光標(biāo)記 以TotalRNA起始，嚴(yán)格按照Roche-NimbleGen試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，取反轉(zhuǎn)錄物，以Random Primer為引物進(jìn)行Klenow酶標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用PCR NucleoSpin Extract II Kit（MN）純化。

2.4 雜交與清洗 將標(biāo)記好的樣品與雜交buffer（3×SSC，0.2%SDS，50×Denhart’s，25%甲酰胺）混勻后，注到已經(jīng)與相應(yīng)混合物黏合的芯片上，采用RocheNimbleGen Hybridization System雜交儀42℃雜交16～20h。雜交結(jié)束后，去除混合物，分別用洗液I、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干，掃描。

2.5 芯片掃描、圖像的采集 采用GenePix4000B（Axon）掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，觀察雜交結(jié)果；采用Gene Pixpro V6.0軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。

2.6 芯片數(shù)據(jù)分析 采用Agilent GeneSpring GX V11.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)所有芯片的Normalized Intensity，F(xiàn)old Change進(jìn)行分析，取其Normalized Intensity做t檢驗(yàn)，設(shè)定判斷差異基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為：Fold-Change＞2.0，P＜0.05為顯著差異表達(dá)基因。使用安捷倫的Gene Spring GX軟件（V11.5.1）進(jìn)行分層聚類。對(duì)差異表達(dá)基因逐一進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如geneontology、GeneBank、KEGG等，進(jìn)行GO和PATHWAY分析。

3 結(jié) 果

3.1 大腸癌組織病理學(xué)觀察 病理切片HE染色檢查，顯示大腸癌圍手術(shù)期氣虛證患者瘤體組織出現(xiàn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，瘤周正常組織無(wú)癌細(xì)胞侵及。見(jiàn)圖1～3（封二）。

3.2 樣本組織總RNA純化及質(zhì)檢 280nm、260nm、

230nm下的吸光度分別代表核酸、蛋白、鹽濃度的值。通常OD260/OD280（Ratio）應(yīng)當(dāng)接近2.0。在1.8～2.1時(shí)，認(rèn)為RNA中蛋白或者其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，OD/260/230（Ratio）應(yīng)當(dāng)大于1.8。經(jīng)核酸定量分析儀檢測(cè)，12例RNA的OD260/OD280在2.0左右，見(jiàn)表1，說(shuō)明提取的RNA純度較高。

表1 利用NanoDrop ND-1000檢測(cè)RNA純度和質(zhì)量的結(jié)果

RNA質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)：有清晰的28S、18S條帶，無(wú)降解，且肉眼觀察28S條帶亮度約是18S的1～2倍。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由電泳圖可見(jiàn)，RNA電泳條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，28S比18S rRNA條帶亮度接近2:1，質(zhì)量合格，總量夠用，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。見(jiàn)圖4。

圖4 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 芯片掃描結(jié)果及分析 對(duì)第一組芯片如前所設(shè)條件進(jìn)行分析，得出大腸癌圍手術(shù)期氣虛證瘤體組和瘤周正常組差異表達(dá)基因共5044條，其中，表達(dá)水平上調(diào)3400條，下調(diào)1644條。經(jīng)檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。主要為與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、谷胱甘肽新陳代謝、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、甾體生物合成，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)基因。對(duì)第二組芯片如前所設(shè)條件進(jìn)行分析，得出大腸癌氣虛證瘤體組和陰虛證瘤體組差異表達(dá)基因共1335條，其中，表達(dá)水平上調(diào)547條，下調(diào)788條。經(jīng)檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。主要為與炎癥、免疫應(yīng)答、礦物質(zhì)吸收、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞黏附、遺傳信息過(guò)程、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、氮代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)基因。陰虛證與氣虛證所涉及炎癥相關(guān)主要差異基因表達(dá)上調(diào)的有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，F(xiàn)ZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。涉及細(xì)胞內(nèi)吞作用（Endocytosis）主要差異基因表達(dá)上調(diào)的有：DNM1，EPN1，F(xiàn)2R，GRK6，IGF1R，IL-2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，氣虛證與陰虛證差異表達(dá)基因主要涉及以下幾類：炎癥，細(xì)胞內(nèi)吞，礦物質(zhì)吸收，酮體合成與分解，免疫功能，信號(hào)傳導(dǎo)通路等。

炎癥是機(jī)體對(duì)致炎因子的損傷所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的基本病理過(guò)程。此過(guò)程主要表現(xiàn)為局部組織發(fā)生變質(zhì)（變性、壞死）、滲出（血管反應(yīng)、液體和細(xì)胞滲出）和增生改變，臨床上有紅、腫、熱、痛和功能障礙，而全身則常伴有不同程度的發(fā)熱、白細(xì)胞增多、代謝增強(qiáng)等。局部發(fā)生的一系列變化，有利于局限、消滅致炎因子和清除壞死組織，促進(jìn)局部修復(fù)，對(duì)機(jī)體是有利的。但是，并不是所有炎癥對(duì)機(jī)體都是有利的，有時(shí)也會(huì)給機(jī)體帶來(lái)危害。本研究中氣虛證與陰虛證涉及相關(guān)主要差異基因表達(dá)上調(diào)的有16條：炎癥主要差異表達(dá)基因有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，F(xiàn)ZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）主要由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，又稱惡液質(zhì)素，活化T淋巴細(xì)胞也可產(chǎn)生一種與TNF-α類似的（有30%左右的同源性）淋巴毒素，并與TNF-α有共同的受體，稱之為TNF-β。TNF-α基因位于第6號(hào)染色體短臂的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）內(nèi)，與TNF-β基因緊密連鎖，存在于C2與HLA-B基因之間。人的TNF-α根據(jù)種屬及分離方法不同，可以二聚體、三聚體和五聚體的形式存在。人的TNF-α為非糖基化蛋白，而幾乎所有動(dòng)物的TNF-α均為糖蛋白。小鼠和人的TNF-α分別由其前體分子在N端脫去76和79個(gè)氨基酸而成[1]。

腫瘤壞死因子是一種具有多種生物功能的促炎細(xì)胞因子。它可以活化內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，參與炎癥細(xì)胞的募集，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其它炎癥因子的表達(dá)從而影響炎癥反應(yīng)的程度[2]。

IL-1Ra也是一類重要的抗炎性細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1Ra可以抑制IL-l與IL-1R結(jié)合，起到抗炎癥作用。IL-1Ra能抑制PGE生成，下調(diào)Cox-2和膠原酶-1的表達(dá)，減輕白細(xì)胞浸潤(rùn)[3]。IL-1Ra可以抑制脂多糖（LPS）刺激的單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-1α和IL-lβ[4]，IL-1Ra能夠與IL-1R結(jié)合，但不能啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。且IL-1Ra可以與IL-l競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-1R，從而阻斷IL-lα/β介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低IL-1的生物學(xué)活性[5]。申維璽等[6-9]運(yùn)用分子生物學(xué)的理論和方法進(jìn)行研究，提出了陰虛證的本質(zhì)可能是白細(xì)胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）等細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生改變；陰虛證的基本發(fā)病學(xué)機(jī)制是由于機(jī)體在各種致陰虛證病因的損害作用下，IL-1、TNF等炎性細(xì)胞因子群的基因表達(dá)水平相對(duì)增強(qiáng)、生物學(xué)活性相對(duì)升高，引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)紊亂和功能態(tài)平衡失調(diào)的結(jié)果。陰虛證時(shí)，機(jī)體免疫力降低，IL-1Ra基因表達(dá)下調(diào)，IL-1Ra產(chǎn)生減少，不能有效抑制IL-1與IL-1R結(jié)合，導(dǎo)致陰虛證時(shí)炎性細(xì)胞因子IL-1等的活性增強(qiáng)。

陰虛證與氣虛證涉及細(xì)胞內(nèi)吞作用（endocytosis）主要差異基因表達(dá)上調(diào)的有10條：DNM1，EPN1， F2R，GRK6，IGF1R，IL2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

細(xì)胞通過(guò)胞吐作用將細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞外，又通過(guò)內(nèi)吞作用將細(xì)胞外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等攝取到細(xì)胞內(nèi)以維持正常的代謝活動(dòng)。細(xì)胞的內(nèi)吞有兩種類型，一種是吞噬細(xì)胞完成的對(duì)有害物質(zhì)的吞噬，另一種類型是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜受體介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的內(nèi)吞。賴梅生等[10]利用具有養(yǎng)陰功效的滋陰清熱方治療SLE陰虛證，治療前高表達(dá)的基因IL-2R，治療后明顯下降，提示IL-2R基因高表達(dá)可能與陰虛證相關(guān)，滋養(yǎng)清熱方作用機(jī)制可能是通過(guò)影響IL-2R表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的內(nèi)吞作用。

本研究亦顯示，與氣虛證相比，陰虛證中與細(xì)胞內(nèi)吞作用的相關(guān)基因IL-2等表達(dá)明顯增加，提示氣虛證與陰虛證可能在有關(guān)影響細(xì)胞內(nèi)吞作用的基因中存在差異。

本研究結(jié)果提示，大腸癌圍手術(shù)期氣虛證與陰虛證存在有組織差異表達(dá)基因組學(xué)背景，發(fā)現(xiàn)的一批大腸癌圍手術(shù)期氣虛證瘤體組與陰虛證瘤體組差異基因，可以進(jìn)一步從功能基因組學(xué)的角度對(duì)其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行深入研究，并進(jìn)而推廣至其他主要證候，尋找新型證候標(biāo)志物，從而作為大腸癌中醫(yī)辨證論治的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為建立科學(xué)評(píng)價(jià)大腸癌的中醫(yī)藥療效指標(biāo)奠定基礎(chǔ)?？梢詮牟煌C候基因表達(dá)譜的差異，探尋“證”的基因表達(dá)譜，進(jìn)一步研究出“證”的基因芯片；同時(shí)，建立不同“證”的基因芯片，將中醫(yī)的“證”制成具有基因表達(dá)水平定性和定量作用的表達(dá)譜芯片，使診斷趨向規(guī)范化；使辨證結(jié)論達(dá)到最佳化，確立治則和選方用藥個(gè)體化，從而實(shí)現(xiàn)中醫(yī)證的臨床診斷治療的現(xiàn)代化。

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Comparison of Differently Expressed Genes Between Patients with Qi Deficiency and Yin Deficiency in Perioper-ative Period of Colorectal Carcinoma

HONG Chaojin1,GUO yong2(advisor).1.Department of Oncology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China;2.First Clinical Medicine School of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective Comparison of differently expressed genes between patients with Qi deficiency and Yin deficiency in perioperative period of colorectal carcinoma.Methods Eight patients with colon carcinoma undergone colectomy were divided into two groups according to the differential diagnosis with TCM syndrome during the perioperative period:Qi deficiency group（n=4）and Yin deficiency group（n=4）.The tumor tissue and corresponding non-tumor normal tissues were collected for detection of gene expression by human gene technology with 45 033 known human genes.The gene chip images of two groups were analyzed by Pathway and GO system.Results A total of 5044 genes expressed differently in colorectal tissue and corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,among which 3400 were up-regulated and 1644 were down-regulated;the expression of 1335 genes were different between Qi deficiency group and Yin deficiency group,among which the expression was elevated in 547 genes and was decreased in 788 genes.After retrieving the public databank,the names and basic information of all these differently expressed genes were obtained.Conclusion Comparing tumor tissue with corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,the differently expressed gene map included apoptosis,cell cycle, vascular smooth muscle contraction,purine and pyrimidine metabolism,signaling pathway,and DNA replication.The difference in gene expression between Qi deficiency and Yin deficiency group included inflammation,immune response,mineral absorption,endocytosis,cell adhesion,genetic information pathway,regulation of actin cytoskeleton, nitrogen metabolism,signaling pathway.

2014-05-28

修回日期：2014-07-14

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（No.2007ZA007）

郭勇，Tel：13588887292