直結(jié)腸癌缺失基因在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)變化及意義

于廣洋，孫 巖，齊 燦，顧興洲，楊小清，韓瑞發(fā)

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211;2天津市泌尿外科研究所;3天津市泌尿外科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

腎細(xì)胞癌(RCC)是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2% ～3%［1，2］。腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是 RCC 最常見(jiàn)類型，占全部 RCC的 80%［2］。直結(jié)腸癌缺失基因(DCC)由Sato等［3］首先確定并命名，是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的最長(zhǎng)的人類抑癌基因。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，DCC不僅在結(jié)腸腫瘤中表達(dá)缺陷，在胰腺、卵巢、子宮、乳腺、血液系統(tǒng)等多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，且與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4～9］。本研究觀察 DCC在ccRCC組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2006年6月～2008年6月具有完整臨床及隨訪資料的ccRCC患者術(shù)后常規(guī)石蠟包埋標(biāo)本132例，均進(jìn)行Fuhrman分級(jí)及2009年AJCC的TNM分期，均由2名病理科醫(yī)師確診，術(shù)前、術(shù)后均未接受放療、化療、免疫治療或靶向治療。同時(shí)取距離病灶2 cm以上的癌旁組織作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 DCC檢測(cè) 采用免疫組化SP法。步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。每例連續(xù)切片5張，厚5μm;切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇逐步水化后，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行微波抗原修復(fù)20 min;3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，避光靜置20 min;滴加DCC一抗，4℃孵育過(guò)夜;取出后37℃復(fù)溫30 min;滴加 HRP標(biāo)記聚合物，37℃孵育20 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS緩沖液為一抗作為陰性對(duì)照。DCC抗體為鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2.2 免疫組化染色結(jié)果判定 DCC蛋白主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色均質(zhì)染色為陽(yáng)性，細(xì)胞不染色或與間質(zhì)背景一致為陰性。隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×400)，根據(jù)著色細(xì)胞數(shù)的比例判定反應(yīng)強(qiáng)度:陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為－，10% ～60%為+，＞60%為++，+、++均記作陽(yáng)性［10］。

1.2.3 隨訪方法 采用電話及書信方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，總體生存時(shí)間定義為術(shù)后至死亡或隨訪終點(diǎn)的時(shí)間。隨訪截止日期為2013年6月。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。DCC在ccRCC與癌旁正常腎組織間表達(dá)差異，及其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性檢測(cè)，采用χ2或Fisher精確性檢驗(yàn)方法。采用Kaplan－Meier法繪制DCC陽(yáng)性與陰性ccRCC患者的生存曲線，采用Log－rank檢驗(yàn)比較DCC陽(yáng)性與陰性ccRCC患者總生存率。采用COX回歸進(jìn)行單因素及多因素分析，判斷影響ccRCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCC表達(dá)情況 DCC在ccRCC組織和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為39.39%(52/132)、100%(132/132)，P ＜0.05。見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖7。

圖7 ccRCC組織及癌旁正常組織中DCC免疫組化染色圖片（×400）

2.2 DCC表達(dá)與ccRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系DCC表達(dá)與ccRCC組織中TNM分期、病理分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤(rùn)相關(guān)(P均＜0.05);與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P 均 ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 ccRCC組織中DCC表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 生存分析結(jié)果 隨訪時(shí)間12～84個(gè)月，中位時(shí)間60個(gè)月。隨訪期間，44例(33.33%)死亡。Log－rank顯示DCC陽(yáng)性及陰性ccRCC患者的總生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。見(jiàn)圖1。

2.4 單因素及多因素分析結(jié)果 DCC表達(dá)情況、TNM分期、病理分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤(rùn)是ccRCC預(yù)后的獨(dú)立影響因子，P均＜0.05。見(jiàn)表2。

3 討論

圖1 DCC陽(yáng)性及陰性ccRCC患者的生存曲線

表2 ccRCC影響因子的COX單因素及多因素分析

DCC定位于18q21.3，有29個(gè)外顯子、28個(gè)內(nèi)含子，現(xiàn)已明確DCC基因含轉(zhuǎn)錄起始部位、信號(hào)肽基因及編碼跨膜蛋白的基因位點(diǎn)。DCC蛋白為跨膜蛋白，主要由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(325個(gè)氨基酸)和細(xì)胞質(zhì)外(1100個(gè)氨基酸)兩部分組成，細(xì)胞膜外多肽的氨基酸順序和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)及相關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白相似，具有同源性［11］。NCAM可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信號(hào)傳遞等［12］。Chan 等［13］報(bào)道，DCC蛋白具有與神經(jīng)生長(zhǎng)因子1(Netrin－1)直接結(jié)合的活性，并能發(fā)揮受體作用，提示DCC蛋白是Nertin－1受體。Netrin受體處于開放(on)狀態(tài)，即與配體結(jié)合時(shí)，傳遞積極的信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移等;處在關(guān)閉(off)狀態(tài)，即未與配體結(jié)合時(shí)，則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此，無(wú)論處在開放還是關(guān)閉狀態(tài)，Netrin－1受體都有活躍的生物學(xué)行為。Mehlen等［14］研究表明，在配體 Netrin－1 存在的環(huán)境中，DCC蛋白具有抗細(xì)胞凋亡的功能;但配體缺乏時(shí)(例如轉(zhuǎn)移狀態(tài))，DCC蛋白可作為腫瘤抑制蛋白，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。這說(shuō)明DCC蛋白可能是一種腫瘤轉(zhuǎn)移或局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的抑制因子，而DCC功能的喪失可以增加配體缺乏環(huán)境中的細(xì)胞生存。Tanaka等［15］將含正常DCC基因的18q導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞株CoKFU和SW480(兩種細(xì)胞株中DCC基因表達(dá)均明顯減少，且有1個(gè)等位基因丟失)中，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞恢復(fù)表達(dá)DCC蛋白，并且腫瘤細(xì)胞在體外環(huán)境下的生長(zhǎng)速度及在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力受到抑制。近期研究發(fā)現(xiàn)，DCC基因低表達(dá)、表達(dá)缺失等現(xiàn)象出現(xiàn)在胰腺、卵巢、子宮、乳腺、前列腺、血液系統(tǒng)等多種腫瘤中，與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4～9］。由此可見(jiàn)，DCC基因缺失或失活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)促發(fā)因素。

ccRCC的發(fā)生、進(jìn)展與復(fù)雜的染色體改變不斷積累密切相關(guān)。目前為止，關(guān)于DCC基因在ccRCC組織標(biāo)本中的研究并不多，并且標(biāo)本例數(shù)較少。Hirata等［16］研究了126例RCC患者基因18q的雜合性缺失(LOH)，其中 LOH 最高頻率(13.5%)發(fā)生在18q21.3。因此，位于18q21.3的DCC和SMAD4作為候選基因，可能影響RCC的發(fā)生、發(fā)展。Dekel等［17］應(yīng)用免疫組化法對(duì)94例RCC標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并隨訪了相應(yīng)患者;結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨訪期間RCC死亡患者中DCC蛋白低表達(dá)率為63%，而術(shù)后無(wú)瘤生存患者中只有36%為DCC蛋白低表達(dá)。因此，DCC蛋白低表達(dá)可能與RCC腫瘤侵襲性、病死率密切相關(guān)［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中DCC陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁正常組織;DCC表達(dá)與ccRCC的TNM分期、病理分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤(rùn)相關(guān);DCC陽(yáng)性和陰性ccRCC患者生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DCC表達(dá)、TNM分期、腫瘤分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤(rùn)是ccRCC預(yù)后的獨(dú)立影響因子;提示DCC基因缺失或失活是ccRCC發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)促發(fā)因素，檢測(cè) DCC表達(dá)對(duì)ccRCC早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估有重要意義，其有可能成為一種新的分子標(biāo)記物，為ccRCC靶向治療等提供理論基礎(chǔ)。

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