姜黃素對(duì)阿霉素致大鼠心臟毒性的保護(hù)作用及機(jī)制探討

(宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興，214200)

阿霉素(ADR)屬于蒽醌類抗生素，被認(rèn)為是最有效的蒽環(huán)類廣譜抗癌藥物之一。然而，ADR在抗腫瘤的同時(shí)具有嚴(yán)重的心臟毒性，臨床應(yīng)用受到限制［1］。ADR的心臟毒性機(jī)制尚未完全明確，然而近期研究表明［2，3］，其心臟毒性與心肌組織大量的自由基生成和脂質(zhì)過氧化引起心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的天然色素，為姜黃的主要活性成分。姜黃素具有抗炎、保肝利膽、抗血脂、抗氧化、抗腫瘤及抗炎等諸多藥理作用［4］。近期研究［5，6］表明，姜黃素對(duì)缺血和炎癥引起的心臟功能損害具有保護(hù)作用。2013年5～6月，我們建立大鼠ADR急性心臟毒性模型，檢測心臟組織中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2水平，以探討姜黃素對(duì)ADR致心臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。藥品:姜黃素(Sigma公司)，用含6%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和6%(體積分?jǐn)?shù))聚乙二醇400的蒸餾水溶解;鹽酸多柔米星注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，采用生理鹽水稀釋。試劑:乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶(CK)試劑盒、肌酸激酶同工酶(CKMB)試劑盒均購于寧波亞太生物技術(shù)公司，SOD試劑盒和MDA試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠Caspase-3和Bcl-2多克隆抗體購自Cell Signaling公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、Western blot封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均來自碧云天生物技術(shù)研究所。其他均為AR級(jí)化學(xué)試劑。實(shí)驗(yàn)儀器:751G-可見紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)，高速勻漿機(jī)(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)，Bio-Rad model 680酶標(biāo)儀、電泳儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和姜黃素低、中、高劑量組各8只。模型組和對(duì)照組每日給予生理鹽水0.02 mL/g灌胃，第5天分別腹腔注射等量生理鹽水、鹽酸ADR 20 mg/kg。姜黃素低、中、高劑量組造模前分別給予10、20、40 mg/kg姜黃素灌胃，1次/d，連續(xù)5 d;于第5天給藥1 h后腹腔注射鹽酸ADR 20 mg/kg，后繼續(xù)給藥2 d。

1.2.2 血清 LDH、CK、CKMB 測定 造模后72 h，戊巴比妥麻醉動(dòng)物，腹腔靜脈取血;開胸取出心臟，將心臟組織置于－80℃超低溫冰箱中保存待用。按試劑盒方法，檢測血清LDH、CK、CKMB。

1.2.3 心臟組織中SOD活性及MDA水平檢測取心臟組織于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進(jìn)行操作，采用比色法檢測SOD活性及MDA水平。

1.2.4 心臟組織Caspase-3和Bcl-2蛋白檢測 采用免疫印跡法。提取心臟組織總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。各取100μg上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠50 g/L，分離膠150 g/L)，100 V轉(zhuǎn)移約120 min。取轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素濾膜(NC膜)，加1∶10稀釋的麗春紅儲(chǔ)存液，搖床室溫緩搖15 min，去離子水洗3 min×5次。將膜置入Western封閉液中，室溫?fù)u床上緩搖封閉2 h，在搖床上快搖洗膜3 min×5次。加特異性一抗，兔抗鼠激活型Caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)抗體。膜置于一抗中，4℃ 冰箱過夜孵育，TBST洗膜5 min×3次。分別加特異性二抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，膜置于二抗液內(nèi)室溫下孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT顯色液顯色。掃描蛋白印跡顯影圖，利用凝膠自動(dòng)分析成像Image J軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)的灰度值，蛋白表達(dá)量以Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用one-way ANOVA分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)大鼠血清心肌酶的影響 見表1。

表1 姜黃素對(duì)大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影響(n=8，U/L，±s)

表1 姜黃素對(duì)大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影響(n=8，U/L，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別LDH CK MDA對(duì)照組198.37 ±35.72 386.47 ± 59.62 535.59 ±63.27模型組 423.18 ±43.25*796.34 ±101.55*806.94 ±90.23*姜黃素低劑量組 351.26 ±31.57 565.20 ± 73.59#683.88 ±62.37#姜黃素中劑量組 289.84 ±26.60#512.37 ± 65.24△ 619.30 ±57.25△姜黃素高劑量組 234.42 ±29.93△ 505.87 ± 73.17△ 573.61 ±65.72△

2.2 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織氧化應(yīng)激的影響 見表2。

表2 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織SOD活性及 MDA 水平的影響(n=8，±s)

表2 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織SOD活性及 MDA 水平的影響(n=8，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 SOD(U/g prot) MDA(mol/g prot)189.41 ±38.60 2.80 ±0.80模型組 102.10 ±24.31* 6.53 ±1.62*姜黃素低劑量組 126.31 ±21.37# 4.95 ±1.47#姜黃素中劑量組 142.31 ±23.58# 3.92 ±1.30△姜黃素高劑量組 159.09±29.71△ 3.25±1.36對(duì)照組△

2.3 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 見表3。

3 討論

ADR可引起心肌損害，且前期研究發(fā)現(xiàn)，ADR引起心肌損害的組織學(xué)變化與人類心肌病心臟損害相似［2］。本研究采用大鼠構(gòu)建ADR心肌損害模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)ADR所致心肌損害具有保護(hù)作用，抑制血清中心肌酶水平的升高，減輕心臟組織的氧化應(yīng)激，而且抑制心臟組織Caspase 3蛋白表達(dá)的升高，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。

表3 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織Caspase 3及 Bcl-2 表達(dá)的影響(n=4，±s)

表3 姜黃素對(duì)大鼠心臟組織Caspase 3及 Bcl-2 表達(dá)的影響(n=4，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

Caspase-3 Bcl-2對(duì)照組組別0.13 ±0.03 0.79 ±0.21模型組 0.37 ±0.08* 0.11 ±0.02*姜黃素低劑量組 0.22 ±0.04# 0.47 ±0.08#姜黃素中劑量組 0.20±0.05△ 0.53±0.14△姜黃素高劑量組 0.17±0.02△ 0.73±0.17△

血清中LDH、CK和CKMB水平能夠反映心肌細(xì)胞的損傷，ADR引起心肌細(xì)胞損傷或者死亡，可導(dǎo)致血清中 LDH、CK和 CKMB水平顯著升高［7］。因此，通過測定上述血清心肌酶的活性，可以評(píng)價(jià)ADR引起的心肌細(xì)胞損傷程度以及藥物的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，ADR顯著升高了大鼠血清中LDH、CK和 CKMB活性，與前期研究結(jié)果相一致［8，9］。提示姜黃素對(duì)ADR導(dǎo)致的心肌損傷具有保護(hù)作用。

此外，ADR的心臟毒性與過量自由基的生成有關(guān)。ADR的半醌結(jié)構(gòu)可引起線粒體呼吸鏈脫偶聯(lián)，誘導(dǎo)自由基的大量生成，而心肌組織中抗氧化酶不足以清除過量生成的自由基，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞能量代謝紊亂［10～12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADR導(dǎo)致心臟組織MDA水平升高，SOD活性降低，這進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激和自由基過量形成參與了 ADR引起的心臟毒性。然而，姜黃素對(duì)ADR致心臟組織MDA水平升高和SOD活性降低具有明顯的抑制作用，提示姜黃素的心肌保護(hù)作用與抑制ADR引起的氧化應(yīng)激有關(guān)。

同時(shí)，機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系［13～15］。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平相對(duì)升高，可啟動(dòng)氧化應(yīng)激鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，易于細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，ADR可致心臟組織凋亡蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而姜黃素顯著抑制了ADR導(dǎo)致的Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，并上調(diào)了Bcl-2蛋白表達(dá)。因此，我們推測姜黃素對(duì)ADR導(dǎo)致的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用的機(jī)制與減少心臟組織MDA過量生成、抑制氧化應(yīng)激、減輕心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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