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    不同pH值對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞MRC-5生長(zhǎng)的影響

    2014-05-21 03:42:20陳通威山西康寶生物制品股份有限公司長(zhǎng)治046011通訊作者mailctw001126com
    關(guān)鍵詞:二倍體細(xì)胞培養(yǎng)纖維細(xì)胞

    陳通威,趙 鵬(山西康寶生物制品股份有限公司,長(zhǎng)治 046011;通訊作者,E-mail:ctw001@126.com)

    細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)三大前沿學(xué)科,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中最常用的方法之一。尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,許多基因工程藥物、疫苗等都離不開最基本的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),人二倍體細(xì)胞系的建立使人用疫苗得到了長(zhǎng)足的發(fā)展[1]。目前,人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)被國(guó)內(nèi)外很多科研單位和細(xì)胞培養(yǎng)工作者使用[2,3]。

    在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),培養(yǎng)液的pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。戴永祥等曾經(jīng)報(bào)道過(guò) MRC-5 生長(zhǎng)適宜的 pH 值為 7.4[4],本文對(duì)MRC-5的生長(zhǎng)pH值范圍進(jìn)行了擴(kuò)展研究,找出了適宜MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳pH值范圍。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累會(huì)改變培養(yǎng)液的pH值,故常用緩沖液或二氧化碳調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH值,本文使用7.5%的碳酸氫鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞 人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5),購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC),經(jīng)自行建庫(kù)后備用,51萬(wàn)個(gè)/ml。

    1.1.2 主要設(shè)備、器材與試劑 生化培養(yǎng)箱,黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。pH計(jì),賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。倒置顯微鏡,重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。超凈工作臺(tái),北京西泰科隆儀器技術(shù)有限公司。數(shù)顯恒溫三用水箱,金壇科興儀器廠。高溫電子滅菌爐,SANYO。高壓蒸汽滅菌器,SANYO。滲透儀,WESCOR。T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,Nucn。細(xì)胞計(jì)數(shù)板,玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

    硫酸慶大霉素,4萬(wàn) U/ml,天津藥業(yè)。MEM,0.95%,GIBCO。胎牛血清,民海生物。谷氨酰胺,高級(jí)純,Amresco;配置成0.2 mol/L溶液。胰酶,1∶250,BD;配置成 0.25%溶液。NaHCO3,AR,國(guó)藥集團(tuán);配置成7.5%溶液。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液配制 MEM細(xì)胞培養(yǎng)液的配制:MEM 935 ml,胎牛血清 50 ml,谷氨酰胺 10 ml,慶大霉素5 ml。將上述溶液分成10份,每份100 ml,取9份,分別滴加不同體積的7.5%NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值,使培養(yǎng)液的 pH 值分別為 6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6。

    1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將配制好的不同pH值細(xì)胞培養(yǎng)液各10 ml,加到T25培養(yǎng)瓶中。從液氮中取出凍存的細(xì)胞,迅速在37.0℃水浴箱中融化,取適量,分別加入裝有不同pH值培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,輕微搖勻,放置在37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換細(xì)胞培養(yǎng)液,以去除細(xì)胞凍存液里的二甲基亞砜(DMSO),之后繼續(xù)放37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài)變化 每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、增殖速度等,并拍照記錄,直至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層為止。

    1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù) 在同一生化培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)96 h后,取出培養(yǎng)瓶,倒掉培養(yǎng)液,加入適量的0.25%胰酶消化液,消化半分鐘后倒掉胰酶消化液,作用約5 min直至細(xì)胞松散脫落,加入10 ml培養(yǎng)液吹打細(xì)胞至分散,制成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察不同pH值培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài),并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

    細(xì)胞計(jì)數(shù)公式:1 ml細(xì)胞數(shù)=n個(gè)方格細(xì)胞數(shù)之和×稀釋倍數(shù)×10 000/n,計(jì)算出不同pH值培養(yǎng)液中每毫升的細(xì)胞數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 不同pH值培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

    取出培養(yǎng)的細(xì)胞并置于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察,可見當(dāng)培養(yǎng)液的pH值<7.0時(shí),MRC-5生長(zhǎng)分裂速度緩慢,顯微鏡下細(xì)胞為圓球形,懸浮在培養(yǎng)液中(圖1A);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.0-7.1之間時(shí),細(xì)胞形態(tài)與培養(yǎng)液pH值為7.2-7.3所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相仿,唯一的區(qū)別是細(xì)胞分裂生長(zhǎng)速度稍慢(圖1B);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.2-7.3之間時(shí),MRC-5細(xì)胞分裂較快,增殖速度迅速,細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞均勻,呈典型的單一梭形外觀,形成細(xì)胞群落(圖1C);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值>7.4時(shí),MRC-5細(xì)胞逐漸停止分裂生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)肥大、邊緣不規(guī)則,且有部分細(xì)胞破碎(圖1D)。

    圖1 不同pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響Figure 1 Effect of pH on the morphology of MRC-5 cells

    2.2 不同pH值培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響

    培養(yǎng)96 h后,分別對(duì)在pH值為6.8-7.6的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果見表1。表1數(shù)據(jù)顯示,當(dāng)培養(yǎng)液的pH值<7.0時(shí),MRC-5細(xì)胞數(shù)目較低;當(dāng)培養(yǎng)液的 pH值在7.0-7.1之間時(shí),細(xì)胞數(shù)目相對(duì)增加;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.2-7.3之間時(shí),MRC-5細(xì)胞數(shù)目明顯增多,且最高可達(dá)2.37×106/ml;當(dāng)培養(yǎng)液的 pH 值 >7.4 時(shí),MRC-5細(xì)胞數(shù)目明顯降低,可見部分細(xì)胞破碎。

    3 討論

    細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于基因工程藥物和疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)化生產(chǎn)非常重要,而細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響極大。細(xì)胞在體外培養(yǎng),人們可以有計(jì)劃、有選擇、有目標(biāo)地控制細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境,從而可以研究某些特殊條件下的細(xì)胞生物學(xué)行為。確立細(xì)胞培養(yǎng)條件,需要在培養(yǎng)溫度、血清濃度、培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)液pH值及培養(yǎng)液滲透壓等方面進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)。其中pH值對(duì)細(xì)胞行為的影響最大,也最為關(guān)鍵,對(duì)細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用[1]。

    表1 pH對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響 (n=3)Table 1 Effect of pH on cell number of MRC-5 (n=3)

    人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)作為國(guó)際認(rèn)可的人二倍體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株,因用其生產(chǎn)出的生物制品無(wú)外源因子、無(wú)外源性細(xì)胞殘余DNA和無(wú)致瘤性。李亞?wèn)|等報(bào)道,在顯微鏡下觀察,MRC-5細(xì)胞呈單一梭形,細(xì)胞均勻[5]。本文用不同pH值的培養(yǎng)液培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞,經(jīng)顯微鏡觀察,分別從細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)兩個(gè)方面進(jìn)行了分析研究,旨在確定MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳pH值范圍。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)液的 pH值 <7.0時(shí),MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,形態(tài)也不規(guī)則;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.0-7.1之間時(shí),細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)速度有所提高,形態(tài)也變得規(guī)則;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值范圍為7.2-7.3時(shí),最適合 MRC-5生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,狀態(tài)良好,且增殖速度最快;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值>7.4時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)速度變得很慢,甚至停止分裂生長(zhǎng),部分細(xì)胞破碎、變形。

    通過(guò)實(shí)驗(yàn)還可以看出,MRC-5細(xì)胞對(duì)pH值>7.4的堿性培養(yǎng)液較敏感,細(xì)胞變形嚴(yán)重;而對(duì)pH值<7.2的酸性培養(yǎng)液,細(xì)胞則其有一定的耐受,故配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)寧可稍偏酸也勿稍偏堿。如果實(shí)驗(yàn)條件允許的話,最好在使用前先測(cè)定其pH值,以確保培養(yǎng)液的pH值是在細(xì)胞生長(zhǎng)的最適范圍內(nèi)。同時(shí),還應(yīng)每天注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況及細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的顏色變化,以便及時(shí)換液或添加NaHCO3。對(duì)于條件較好的實(shí)驗(yàn)室,可以直接將細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口微旋,放入CO2孵箱中培養(yǎng),在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)[6,7],這樣可以使細(xì)胞在整個(gè)生長(zhǎng)周期中的pH值保持恒定,避免在細(xì)胞生長(zhǎng)后期因數(shù)量多、代謝快而引起細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值下降,最終導(dǎo)致細(xì)胞的脫落和死亡。

    細(xì)胞培養(yǎng)最適生長(zhǎng)條件是實(shí)驗(yàn)成功、企業(yè)規(guī)?;a(chǎn)的前提,本文對(duì)MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)液的最適pH值范圍進(jìn)行了科學(xué)性和重復(fù)性研究,為MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)后續(xù)階段的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

    [1] 李元.基因工程藥物[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:82-86.

    [2] 張文娟,紀(jì)衛(wèi)東,楊淋清,等.人胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的早衰研究[J].衛(wèi)生研究,2009,38(2):139-143.

    [3] Saeed K,Pelosi E.Comparison between turnaround time and cost of herpes simplex virus testing by cell culture and polymerase chain reaction from genital swabs[J].Int J STD AIDS,2010,21(4):298-299.

    [4] 戴永祥,管政德,胡曉玉,等.人二倍體細(xì)胞 KMB-17株和MRC-5株生物學(xué)性質(zhì)比較[J].動(dòng)物學(xué)研究,1985,6(4):313-317.

    [5] 李亞?wèn)|,牛建昭,王繼峰,等.循環(huán)纖維細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞的比較研究[J].解剖學(xué)報(bào),2007,38(3):300 -303.

    [6] 李映紅,吳正治,吳偉康,等.天然腦活素促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞衰老作用的研究[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,17(6):336-340.

    [7] 婁小燕,孫愛軍,王克強(qiáng),等.電轉(zhuǎn)染技術(shù)促進(jìn)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞的衰老進(jìn)程究[J].上海醫(yī)學(xué),2009,32(4):308-311.

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