基于UPLC-TOF-MS研究冰片對(duì)丹參酮ⅡA在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

張璠璠，王宇光，梁乾德，馬增春，湯響林，譚洪玲，肖成榮，趙永紅，高 月

（1.中南大學(xué)研究生院，湖南長(zhǎng)沙 410000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及根莖。丹參性苦，微寒；歸心、肝經(jīng)。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，稱其“主心腹邪氣，破散除瘕，止煩滿”，為治療心血管疾病的良藥［1］。臨床上常用于治療月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，瘕積聚，肝脾腫大，心絞痛等疾?。?］。丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TS）是從丹參的根中提取分離的二萜醌類化合物，為丹參中的有效成分，具有多種藥理活性，如抗菌、抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加心肌血流量等功效［3］。復(fù)方丹參方是活血化瘀、芳香開(kāi)竅、理氣止痛的名方，臨床上常用于治療心血管疾病，本研究選擇復(fù)方丹參方中使藥冰片和君藥丹參作為研究對(duì)象。進(jìn)一步研究冰片對(duì)丹參體內(nèi)過(guò)程的影響，特別是對(duì)主要成分丹參酮ⅡA的體內(nèi)過(guò)程影響，有助于探究中藥復(fù)方配伍增效的科學(xué)性。目前研究多集中于冰片與丹參中水溶性成分的配伍，但脂溶性成分丹參酮ⅡA較少研究，但丹參酮ⅡA是丹參中丹參脂溶性成分含量最大的有效活性成分［4］，也是發(fā)揮藥效的重要成分，因此有必要研究冰片對(duì)丹參酮ⅡA體內(nèi)過(guò)程的影響，為研究復(fù)方丹參方配伍組方的合理性提供體內(nèi)過(guò)程的證據(jù)。

冰片是中醫(yī)藥中常用的佐藥，具有開(kāi)竅醒神、清熱止痛、生肌之效。為小分子脂溶性單萜類物質(zhì)?！侗静菥V目》言其能“通諸竅”。作為藥引，冰片在許多方劑中起到增加其他藥物的治療效果，即所謂的“芳香走竄，引藥上行”，“獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”的作用。已有研究顯示，冰片與其他藥物配伍可以提高藥物的生物利用度、促進(jìn)開(kāi)放血腦屏障、增加藥物在組織中的分布等［5-7］，目前研究冰片與丹參中水溶性成分的配伍較多，但是冰片與脂溶性成分丹參酮IIA的配伍卻未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了超高效液相色譜（UPLC）檢測(cè)大鼠血漿中丹參酮ⅡA的分析方法，進(jìn)一步檢測(cè)并分析了兩者配伍前后對(duì)丹參酮ⅡA藥代動(dòng)力學(xué)行為的影響，以闡明冰片對(duì)丹參酮ⅡA藥代動(dòng)力學(xué)的改變與復(fù)方丹參方配伍合理性的關(guān)系。

丹參酮ⅡA，冰片以及內(nèi)標(biāo)物苦杏仁苷的結(jié)構(gòu)式如下：

1 材料

1.1 儀器 Acquity UPLC-Synapt MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Water公司）、Acquity CSHTMC18色譜柱（100 mm×2.1 mm I.D，1.7μm，Waters公司）、MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站（Water公司）、純水儀（Millipore Simplicity）、冷凍離心機(jī)（Heraeus Labofuge 400R）

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-200619）、冰片（購(gòu)于安徽綠源公司，經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所馬百平教授鑒定）、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）、甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、肝素鈉（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)1207106）。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠♂，體質(zhì)量（220～250）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)SCXK-（京）-2012-0001。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子 V模式檢測(cè)：m／z范圍為70-1000，毛細(xì)管電壓為2.9 kV，錐孔電壓為40 kV，離子源溫度為100℃，脫溶劑溫為450℃，脫溶劑氣體流速為900 L·h-1，錐孔氣流量為50 L·h-1，質(zhì)量校正質(zhì)核比為556.2771［8］。流動(dòng)相為A相0.10%甲酸水溶液，B相為0.10%甲酸乙腈溶液；流速0.40 ml·min-1，柱溫40℃；進(jìn)樣量為8μl。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定丹參酮ⅡA對(duì)照品5 mg，甲醇溶解于50 ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，制備成100 mg·L-1對(duì)照品儲(chǔ)存溶液。

2.3 血漿樣品制備 取大鼠全血，4 000 r·min-1離心10 min，取上清100μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（0.1 mg·L-1苦杏仁苷），混勻，加入乙腈300μl，渦流震蕩10 min，離心 10 min（13 000 r·min-1），取上清 200 μl。

2.4 動(dòng)物手術(shù) SD大鼠實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行右頸靜脈插管手術(shù)，大鼠麻醉后，剃毛，暴露右頸術(shù)野，作一5 mm切口。鈍性分離出右頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端后作一小切口，插入PE管后結(jié)扎固定，導(dǎo)管經(jīng)頸背部皮下穿出。確保血流通暢后，固定于后背上。術(shù)后恢復(fù)用于實(shí)驗(yàn)。

2.5 標(biāo)曲溶液的配制 取大鼠空白血漿100μl，加入丹參酮ⅡA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl，配制成相當(dāng)于濃度為 0.06、0.02、0.01、0.008、0.004、0.002和 0.001 mg·L-1的血漿樣品，按照上述“2.3”項(xiàng)下操作。

2.6 回收率、精密度和穩(wěn)定性溶液的配制 精密加入空白大鼠血漿100μl及不同質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA對(duì)照品，溶液置EP管中，渦旋混合，配制成高、中、低（0.04、0.02、0.01 mg·L-1）3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)專屬性 取空白血漿和空白血漿加丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，按照分析方法和色譜條件，進(jìn)樣，得出選擇離子流圖見(jiàn)Fig 1，經(jīng)比較，空白血漿中的雜質(zhì)不干擾丹參酮ⅡA的測(cè)定，可以用來(lái)定量分析。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以血漿中待測(cè)物濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，回歸方程為＾Y＝0.5127C-0.0001，r＝0.999，n＝7，丹參酮ⅡA的線性范圍為0.001～0.06 mg·L-1。

3.3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 平行操作4次，高、中、低平均方法回收率為108.0%、106.5%、101.6%。處理后的樣品置于冰箱中保存，于1 d內(nèi)進(jìn)樣，計(jì)算高、中、低日內(nèi)精密度 RSD分別為4.9%，8.0%，5.3%，連續(xù)4 d，每天每個(gè)濃度進(jìn)樣1次，計(jì)算高、中、低日間精密度分別為3.7%、3.3%、4.6%。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別考察樣品在室溫條件下放置12、36h，以及-20℃冷凍放置4d期間反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。結(jié)果 RSD分別為：3.7%、1.3%、6.0%，表示穩(wěn)定性良好。

3.5 丹參酮ⅡA在大鼠血漿中藥物濃度測(cè)定結(jié)果SD大鼠20只，按體重隨機(jī)分為4組，每組5只，實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h，不禁水，于給藥后 5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、360、720、1440 min從右頸靜脈取血500μl，并同時(shí)補(bǔ)充相等體積的生理鹽水，置肝素鈉處理后的離心管中，按“2.3”項(xiàng)下處理、分析。測(cè)得平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)Fig 2、3、4。采用DAS軟件計(jì)算大鼠單次口服丹參酮IIA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

Fig 1 Representative selected reaction monitoring（SRM）chromatograms of plasma sample determined bypresent UPLC-TOF-MS methodA：Blank plasma sample；B：Blank plasma sample spiked with 0.04 mg·L-1 tanshinoneⅡA（Ⅱ）and internal standard（Ⅰ）；C：Plasma sample withrawn at 0.25 h after oral administration 0f TSIIA at a dose of 15 mg·L-1 to a SD rat；Ⅰ ＝Amygdalin，Ⅱ ＝tanshinoneⅡA.

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in ratsˉx±s，n＝8）

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in ratsˉx±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（given TsIIA alone）

eters TanshinoneⅡA borneol（0-t） 5.502±1.126 16.141±3.438** 7.895±1.408**0 mg·kg-1 borneol 15 mg·kg-1 borneol 30 mg·kg-1 borneol 60 mg·kg-1 7.508±1.784 AUC（0-∞） 5.97±1.65 16.8±3.799** 8.394±1.747 7.565±1.786 C max 0.009±0.001 0.039±0.004** 0.013±0.002** 0.012±0.002*MRT（0-t） 459.296±81.337 470.666±88.788 460.352±67.805 443.052±68.571 T max 312±107.331 15±0** 228±130 253.333±165.731 CLz 2647.631±618.316 934.916±249.994** 1865.021±474.349 2098.911±605.837 T1 2 z 308.773±139.763 283.81±92.252 286.012±136.173 192.547±23.12 Vz 1089165.7±283857 361684.62±65778.83** 729473.82±273982.76 583963.22±186964.37*

4 討論

藥物的配伍在臨床合理用藥方面有十分重要的意義，對(duì)于中藥復(fù)方進(jìn)行體內(nèi)成分間相互作用及其與增效的關(guān)系十分必要。本研究采用的超高效液相色譜／四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度、高選擇性等特點(diǎn)，是一種較好的定性定量方法，為目前分析中藥復(fù)雜系統(tǒng)有力的工具之一［9-11］。通過(guò)研究冰片對(duì)丹參酮IIA體內(nèi)過(guò)程的影響來(lái)闡述二者的配伍增效規(guī)律，為臨床用藥和組方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Tab 1和Fig 2、3、4中所列，和單獨(dú)口服丹參酮IIA相比，在口服15、30、60 mg·kg-1的冰片后丹參酮ⅡA的 AUC（0-T）和 Cmax明顯提高，提示冰片增加了丹參酮IIA的口服吸收，顯示了冰片在復(fù)方丹參方配伍增效中扮演重要角色，有助于解釋組方的合理性和科學(xué)性。這也為其他中藥復(fù)方的配伍提供借鑒和參考。

研究表明，冰片能促進(jìn)藥物透過(guò)血腦屏障、黏膜、皮膚等［12］，主要與其通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的含量，影響P-糖蛋白的表達(dá)，升高一氧化氮（NO）的含量有關(guān)，冰片對(duì)藥物代謝酶的影響也很大［13］，進(jìn)而影響其他藥物的吸收，并進(jìn)一步改變其在體內(nèi)代謝行為，提高其他藥物的生物利用度，產(chǎn)生復(fù)方成分間增效的相互作用。已有的研究顯示冰片具有一定的毒性，如何在發(fā)揮冰片增效的同時(shí)盡量避免冰片出現(xiàn)毒性反應(yīng)，就要對(duì)冰片在組方中用量進(jìn)行科學(xué)研究，本次研究顯示小劑量15 mg·kg-1時(shí)對(duì)丹參酮ⅡA具有明顯的增強(qiáng)其生物利用度的作用，更高劑量冰片反而對(duì)丹參酮ⅡA的增效作用沒(méi)有小劑量明顯，因此促進(jìn)丹參的生物利用度的同時(shí)，盡量減少或降低冰片的用量，對(duì)于復(fù)方的有效性和安全性更有意義。

本研究顯示丹參酮ⅡA在大鼠體內(nèi)的藥時(shí)曲線呈現(xiàn)不規(guī)則的多峰現(xiàn)象，可能與肝腸循環(huán)、多部位吸收、藥物在組織分布后的再吸收、藥物制劑的因素、個(gè)體差異、血流動(dòng)力學(xué)等因素有關(guān)。造成多峰原因可能是一個(gè)或多個(gè)因素綜合作用的結(jié)果［14-15］，這些需要進(jìn)行組織分布實(shí)驗(yàn)和通過(guò)考察肝腸循環(huán)現(xiàn)象來(lái)確證等。

綜上，本文比較了正常大鼠單獨(dú)給予丹參酮ⅡA和與冰片配伍后給藥，丹參酮ⅡA的體內(nèi)過(guò)程，二者均符合非房室模型。丹參酮ⅡA和冰片配伍后，與丹參酮ⅡA單獨(dú)給藥比較，丹參酮ⅡA的最高血藥濃度（Cmax）增大，藥-時(shí)曲線面積（AUC）明顯增加。提示冰片可促進(jìn)丹參酮ⅡA的吸收，提高其生物利用度。特別是在冰片低劑量時(shí)效果更加明顯，顯示出冰片增丹參之效的配伍特點(diǎn)。

Fig 2 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，15 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 3 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，30 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 4 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，60 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

參考文獻(xiàn)：

［1］ Wan R Z，Xu Y Y，Lin Y P，et al.Enhancing effects of different dosages of borneol on pharmacokinetics of salvanic acid B after oral administration to rats［J］.J Asian Nat Prod Res，2012，14（6）：538-44.

［2］ 姜清華，鄧晶晶，菅凌燕.丹參酮ⅡA的藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（1）：126-7.

［2］ Jiang Q H，Deng JJ，Jian L Y.Research progress of pharmacokinetics of TanshinoneⅡA［J］.Chin Arch Tradit Chin Med，2012，30（1）：126-7.

［3］ 丁建剛，高允生，劉江林，等.HPLC-MS／MS法測(cè)定比格犬血漿中丹參酮ⅡA的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（5）：769-72.

［3］ Ding JG，Gao Y S，Liu J L，et al.HPLC-MS／MSdetermination of tanshinoneIIA in Beagle dog plasma［J］.J Pharm Anal，2009，29（5）：769-72.

［4］ Tzu Y L，Cheng WL，Shu K H，et al.Tanshinone IIA，a constituent of Danshen，inhibits the release of glutamate in rat cerebrocortical nerve terminals［J］.J Ethnopharmacol，2013，147（2）：488-96.

［5］ Li W R，Yao L M，Mi SQ，et al.Relation of openness of bloodbrain barrier by borneol with histamine and 5-hydroxytryptamine［J］.Chin J Clin Rehabil，2006，10（3）：937-9.

［6］ Cheng C，Liu X W，Du F F，et al.Sensitive assay for measurement of volatile borneol，isoborneol，and the metabolite camphor in rat pharmacokinetic study of Borneolum（Bingpian）and Borneolum syntheticum（synthetic Bingpian）［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34（10）：1337-48.

［7］ Cai Z，Hou SX，Li Y B，et al.Effect of borneol on the distribution of gastrodin to the brain in mice via oral administration［J］.J Drug Target，2008，16（2）：178-84.

［8］ Zhou SS，Ma Z C，Gao Y，et al.UPLC／Q-TOF-MSbased chemical profiling approach to evaluate chemical composition of augmenta-tion toxicity in combination of radix aconite and pinellia praeparata［J］.Acta Chim Sin，2012，70（3）：284-90.

［9］ Deng S，West B J，Jensen C J.UPLC-TOF-MS characterization and identification of bioactive iridoids in cornus mas fruit［J］.J A-nal Methods Chem，2013，2013：710972.

［10］Orhan N，Aslan M，Sukuroglu M，Deliorman Orhan D.In vivo and in vitro antidiabetic effect of Cistus laurifolius L.and detection of major phenolic compounds by UPLC-TOF-MS analysis［J］.J Ethnopharmacol，2013，146（3）：859-65.

［11］Zhou SS，Ma Z C，Gao Y，et al.UPLC／Q-TOF-MSbased chemical profiling approach to evaluate the chemical constitution of radix aconiti lateralis preparata in the process of decoction［J］.Chin J Integr Med，2012，10（8）：894-900.

［12］田秀峰，李鵬躍，王宏潔.冰片對(duì)梔子在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（14），135-8.

［12］Tian X F，Li PY，Wang H J.Effects of borneol on pharmacokintics of geniposide of Gardenia Jasminoides in Mice［J］.Chin J Exp Tradit Med Form，2012，18（14）：135-8.

［13］胡東華，王宇光，陳志武.復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞色素酶的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（4）：678-84.

［13］Hu D H，Wang Y G，Chen Z W.Effect of compound Danshen dripping pills on rat hepatic cytochrome P450 in mice［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2013，27（4）：678-84.

［14］鄭 萍，胡敏燕，劉世霆.卡馬西平吸收的多峰現(xiàn)象［J］.中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，1999，8（3）：184-6.

［14］Zheng P，Hu M Y，Liu ST.The multimodal phenomenon of carbamazepine in absorbing［J］.Chin J Chin，1999，8（3）：184-6.

［15］魏鳳環(huán)，王永剛，羅佳波.藥動(dòng)學(xué)多峰現(xiàn)象研究概況［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（23）：1772-4.

［15］Wei F H，Wang Y G，Luo J B.The research survey of the multimodal phenomenon on pharmacokinetics［J］.Chin Pharm J，2005，40（23）：1772-4.