β1-AR對心衰心室肌細(xì)胞快激活延遲整流鉀電流的調(diào)控機制

汪和貴，王 森，陳艷紅，鄒建剛，柯永勝

（1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心臟科，江蘇南京 210029）

慢性心衰患者易在運動和情緒激動等交感神經(jīng)興奮的情況下，誘發(fā)惡性室性心律失常甚至猝死?？旒せ钛舆t整流鉀電流（IKr）是心肌細(xì)胞復(fù)極3期的主要鉀電流，在心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極過程中起關(guān)鍵作用［1］。最近的實驗研究證明一些G蛋白偶聯(lián)受體，如α-AR和 β-AR通過細(xì)胞內(nèi) cAMP、PKA和PKC調(diào)節(jié)hERG通道的功能［2-6］。這些研究表明腎上腺素的刺激影響hERG通道的活性。但是，目前β-AR對心衰心室肌細(xì)胞IKr／hERG通道的調(diào)控及其細(xì)胞內(nèi)信號機制知之甚少，有待深入研究。因此，本研究分離豚鼠心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察β1-AR瞬時激活對心衰心室肌細(xì)胞IKr的調(diào)控，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物：♂豚鼠，體質(zhì)量200～250 g，由南京青龍山動物中心提供。所有實驗動物的管理均遵循中華人民共和國衛(wèi)生部動物實驗管理條例。

1.2 主要試劑、溶液及儀器 扎莫特羅（Xamoterol，選擇性 β1-AR激動劑）、CGP20712A（選擇性β1-AR阻滯劑）、KN93（特異性CaMKⅡ抑制劑）購自美國Sigma公司；KT5720（特異性PKA抑制劑）購自Merck公司。

臺氏液 （mmol· L-1）：NaCl 137，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，CaCl21.8，pH 7.4 with NaOH；無鈣液（mmol·L-1）：NaCl 137，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，pH 7.4 with NaOH；KB液（mmol·L-1）：KOH 85，L-Glu 70，Tuarine 20，KCl 20，KH2PO430，HEPES 10，Glucose 10，EGTA 0.5，pH 7.4 with KOH；電極內(nèi)液（mmol·L-1）：Potassium aspartate 120，KCl 20，MgCl22.0，HEPES10，EGTA 10，Na2ATP 10；pH 7.2 with KOH。細(xì)胞外液（mmol·L-1）：Choline Chloride 137，KCl 5.4，MgCl21，CaCL21.8，PES 10，Glucose 10，CoCl22，pH 7.4 with KOH。記錄IKr尾電流時細(xì)胞外液中加入 nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol293B（10 μmol·L-1）。

RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)，中國成都儀器廠；心臟超聲心動圖，Sonos 5500，Hewlett Packard，美國；膜片鉗放大器，EPC-9，HEKA，德國。

1.3 心衰模型制備與分組 豚鼠皮下注射阿托品（0.10 mg·kg-1），腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）麻醉，1%利多卡因局麻、消毒、氣管插管、正壓通氣。在胸部左側(cè)第3、4肋間隙縱行剪開皮膚，打開胸腔，分離出降主動脈，縮窄降主動脈，抽吸胸腔，荷包縫合，拔除氣管插管，恢復(fù)自主呼吸。術(shù)后豚鼠側(cè)臥，肌肉注射青霉素（4×105U·kg-1）預(yù)防感染，保暖，補充水、飼料和蔬菜。術(shù)后模型組及假手術(shù)對照組同室喂養(yǎng)12周，每天觀察豚鼠呼吸、毛發(fā)色澤及活動情況。

心臟超聲心動圖檢查由同一資深超聲技術(shù)人員進行操作。應(yīng)用Sonos 5500型超聲心動圖檢查儀，心臟探頭11-3L，頻率為10MHz。用二維切面超聲，選取豚鼠左室長軸、短軸和心尖四腔切面結(jié)合M型和多普勒超聲進行檢查，主要觀察左室內(nèi)徑大小，測量左室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESd）、短軸縮短率（FS）；心臟左室射血分?jǐn)?shù)（EF值）由超聲儀軟件自動計算所得。所有數(shù)值均測量3個連續(xù)心動周期，然后取其平均值，以排除測量時的人為誤差。

將分離出的對照組與心衰組豚鼠心室肌細(xì)胞，分為：空白對照組、PKA抑制劑組（細(xì)胞用2.5μmol·L-1特異性 PKA抑制劑 KT5720孵育1 h）及CaMKⅡ抑制劑組（細(xì)胞用10μmol·L-1特異性CaMKⅡ抑制劑KN93孵育30 min）。心肌細(xì)胞與玻璃微電極封接、破膜后，記錄給藥前的IKr尾電流，再給予10μmol·L-1扎莫特羅灌流，記錄IKr尾電流。

1.4 IKr電流及動作電位記錄方法 在電壓鉗模式下，從-40mV開始以階躍電壓20mV的方式逐步去極化至40mV，脈寬200 ms，刺激從相應(yīng)電壓降至-40mV，脈寬600 ms，誘發(fā)IKr外向尾電流。

在電流鉗模式下，采用膜片鉗技術(shù)記錄豚鼠心室肌細(xì)胞膜動作電位（APD）；給予脈寬5 ms，以1Hz頻率電流刺激誘發(fā)動作電位。記錄扎莫特羅對心衰心室肌細(xì)胞APD的作用時，在細(xì)胞外液中加入nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol（10μmol·L-1）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 膜片鉗數(shù)據(jù)采用IGOR軟件（IGOR Pro4.0+，HEKA，Germany）進行分析，實驗結(jié)果均采用±s表示，用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，配對資料采用配對t檢驗，多組比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠慢性心衰模型的有效性 縮窄豚鼠降主動脈12周后，采用心臟超聲心動圖檢測豚鼠左心室內(nèi)徑及心功能的變化（Tab 1，F(xiàn)ig 1），結(jié)果顯示：心衰組豚鼠左室射血分?jǐn)?shù)（EF）及左室短軸縮短率（FS）與對照組比較明顯降低（P＜0.01）；心衰組豚鼠左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）及左室收縮末期內(nèi)徑（LVSDd）與對照組比較明顯增大（P＜0.05，和 P＜0.01）。采用心電圖檢測心衰豚鼠QTc的變化，結(jié)果顯示：心衰組豚鼠QTc與對照組比較明顯延長（Tab 1，P＜0.01）。同時觀察到心衰組豚鼠有不同程度的胸水與腹水。

Tab 1 Changes of echocardiography and electrocardiogram in guinea pigs with CHF（n＝10）

Fig 1 Changes of echocardiography in guinea pigs with CHF

2.2 β1-AR激動劑扎莫特羅對心衰心室肌細(xì)胞IKr的影響 IKr特異性阻斷劑 dofetilide（1μmol·L-1）完全阻斷IKr外向尾電流（Fig 2），證明該電流為IKr尾電流，不含有其它電流。

在灌流液中加入扎莫特羅（10μmol·L-1）2～3 min后，IKr外向尾電流開始減少，10 min左右IKr尾電流的抑制作用達(dá)到穩(wěn)態(tài)。在預(yù)刺激電壓為+40mV時，扎莫特羅作用10 min后，對照組心室肌細(xì)胞 IKr尾電流減少了（53±4）%（Fig 3A，n＝6，P＜0.01），心衰心室肌細(xì)胞IKr尾電流減少了（52±8）%（Fig 3B，n＝6，P＜0.01）。扎莫特羅對兩組心肌細(xì)胞抑制程度差異無顯著性。Fig 3C為扎莫特羅對兩組心肌細(xì)胞IKr尾電流影響的時程關(guān)系。以上結(jié)果表明，β1-AR激活抑制心衰豚鼠心室肌細(xì)胞IKr尾電流。

2.3 扎莫特羅通過β1-AR抑制心衰心室肌細(xì)胞IKr為了進一步證實扎莫特羅是否通過β1-AR抑制心室肌細(xì)胞IKr，我們在正常豚鼠及心衰豚鼠心室肌細(xì)胞上，應(yīng)用選擇性β1-AR阻滯劑CGP20712A（10μmol·L-1）預(yù)處理后，扎莫特羅作用10 min后，IKr尾電流分別降低了（10±2）%和（8±1）%（P＜0.01與扎莫特羅單獨作用比較，F(xiàn)ig 4）。結(jié)果顯示，CGP20712A完全抑制扎莫特羅對心室肌細(xì)胞IKr的減弱作用。

2.4 扎莫特羅通過PKA通路抑制IKr在細(xì)胞外液中加入特異性PKA抑制劑KT5720（2.5μmol·L-1）預(yù)處理1 h后，扎莫特羅（10μmol·L-1）作用10 min后僅使對照組與心衰心室肌細(xì)胞IKr尾電流分別減少了（30±2）%與（28±3）%（Fig 5A、B、C）；扎莫特羅（10μmol·L-1）單獨作用使對照組與心衰心室肌細(xì)胞IKr尾電流分別減少了（53±4）%、（52±8）%（n＝5或6，P＜0.05與扎莫特羅作用比較，F(xiàn)ig 5C）。結(jié)果提示，PKA通路部分介導(dǎo)了扎莫特羅對IKr的抑制作用。

2.5 扎莫特羅不通過鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ途徑調(diào)節(jié)IKr在細(xì)胞外液中加入特異性CaMKⅡ抑制劑KN93預(yù)處理30 min后，扎莫特羅仍對心室肌細(xì)胞IKr產(chǎn)生明顯的抑制作用（Fig 6A、B），與扎莫特羅組比較差異無顯著性（Fig 6C），結(jié)果提示，CaMKⅡ通路不參與扎莫特羅對IKr的抑制作用。

Fig 2 Effects of dofetilide on I Kr tail current in CHF ventricular myocytes

Fig 3 Effects of xamoterol on I Kr in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol on I Kr tail currents in control and CHF ventricular myocytes.C：Time-dependence of current reduction by xamoterol in control and CHF myocytes（n＝6 cells，**P＜0.01，Xamo+CTL vs CTL；##P＜0.01，Xamo+CHF vs CHF）.

Fig 4 Effects of CGP20712A（CGP）on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of CGP on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of CGP.**P＜0.01，Xamo+CGP vs Xamo.

Fig 5 Effects of KT5720 on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of KT5720 on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of KT5720.*P＜0.05，Xamo+KT5720 vs Xamo.

Fig 6 Effects of KN93 on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of KN93 on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of KN93.

2.6 扎莫特羅對心衰心肌細(xì)胞動作電位時程的影響 為了記錄扎莫特羅對心衰心室肌細(xì)胞ADP的影響，我們在細(xì)胞外液中加入nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol（10μmol·L-1），排除扎莫特羅對L型Ca2+通道及IKs通道的作用。結(jié)果顯示，扎莫特羅（10μmol·L-1）明顯延長心衰心室肌細(xì)胞ADP90［（16.9±1.06）%，n＝4，P＜0.05與心衰組比較，F(xiàn)ig 7］。

Fig 7 Effects of xamoterol（Xamo）on action potential duration in CHF ventricular myoctyes

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)：（1）β1-AR激活抑制心衰心室肌細(xì)胞IKr；（2）心衰時β1-AR激活通過PKA途徑抑制心室肌細(xì)胞的IKr；（3）心衰時β1-AR激活不通過CaMKⅡ途徑抑制心室肌細(xì)胞的IKr。

3.1 β1-AR激活抑制心衰心室肌細(xì)胞IKr交感神經(jīng)興奮，兒茶酚胺分泌增加，與細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)的相應(yīng)受體作用，產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。最近的研究表明G-蛋白偶聯(lián)受體如α-和β-AR通過細(xì)胞內(nèi)cAMP，PKA和PKC調(diào)節(jié) hERG鉀通道的功能［2-5］，提示自主神經(jīng)刺激與心臟復(fù)極之間有一定的聯(lián)系。

本實驗結(jié)果表明，選擇性β1-AR激動劑扎莫特羅（10μmol·L-1）［6］抑制心衰豚鼠心室肌細(xì)胞的IKr，延長APD；特異性β1-AR阻斷劑 CGP20712A能夠完全抑制扎莫特羅對IKr的減弱作用，表明扎莫特羅通過β1-AR抑制心衰心室肌細(xì)胞的IKr。既往研究［6］報道異丙腎上腺素（10μmol·L-1）抑制正常豚鼠心室肌細(xì)胞IKr，主要通過β1-AR起作用。在犬心室肌細(xì)胞，Harmati等［3］發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素（100 nmol·L-1）增加IKr，由 PKA通路介導(dǎo)。產(chǎn)生結(jié)果不一致的原因可能有：（1）實驗技術(shù)、方法以及物種不同。Karle等［6］與我們的實驗均采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及相同的動物，實驗結(jié)果是一致的。（2）藥物濃度的差異，我們實驗中使用的藥物濃度是Harmati等使用的100倍。（3）β1-AR激活通過與Gs蛋白偶聯(lián)，刺激腺苷酸環(huán)化酶（AC），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增加，cAMP可通過直接與hERG通道中的cBND位點結(jié)合增加IKr；另一方面cAMP還能激活 PKA，抑制 IKr，產(chǎn)生雙向調(diào)控 IKr的作用［7］。

3.2 β1-AR激活抑制心衰心室肌細(xì)胞IKr的機制

β1-AR主要信號導(dǎo)途徑為 Gs-AC-cAMP-PKA，PKA催化底物蛋白磷酸化［8］。特異性PKA抑制劑KT5720可明顯減弱扎莫特羅對心衰心室肌細(xì)胞IKr的抑制作用，提示β1-AR激活部分通過PKA通路抑制心衰心室肌細(xì)胞IKr。心衰時β1-AR細(xì)胞內(nèi)信號途徑可能發(fā)生轉(zhuǎn)換，如β1-AR／Ca2+／鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+／CaMKⅡ）信號途徑可能起作用。關(guān)于CaMKⅡ?qū)︹涬娏鞯恼{(diào)控多集中于IKs電流的研究，對IKr電流研究很少。特異性CaMKⅡ抑制劑KN93對扎莫特羅抑制心室肌細(xì)胞IKr的作用無明顯影響，提示CaMKⅡ通路不參與β1-AR對心衰心室肌細(xì)胞IKr的抑制作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，扎莫特羅對正常和心衰豚鼠心室肌細(xì)胞IKr的抑制作用無差異，其原因可能有：（1）心衰時β1-AR下調(diào)［4］，扎莫特羅激活 β1-AR抑制 IKr電流作用減弱；（2）心衰時 PKA活性增加［9］，β1-AR激活通過Gs-cAMP-PKA通路抑制IKr電流增強；（3）心衰時細(xì)胞內(nèi)信號機制十分復(fù)雜，如Gs-cAMP表達(dá)發(fā)生變化；其他信號通路，如 A激酶錨定蛋白（AKAPs）［10］通路及 PKC通路等是否參與 β1-AR對IKr電流的調(diào)控有待進一步研究。

3.3 β1-AR調(diào)控心衰心室肌細(xì)胞IKr／hERG通道的臨床意義 IKr通道對維持心臟正常的電生理活動起著重要的作用，在病理狀態(tài)下，如心力衰竭，導(dǎo)致hERG／IKr通道功能障礙，心肌細(xì)胞復(fù)極延遲，動作電位彌散，參與心律失常的發(fā)生［11］。心衰患者在運動或情緒激動時，交感神經(jīng)系統(tǒng)被激活，從而導(dǎo)致局部和循環(huán)中兒茶酚胺濃度增高。慢性心衰患者血漿去甲腎上腺素水平達(dá)3μmol·L-1，運動時達(dá)15μmol·L-1［12］。在心力衰竭及先天性 LQTS患者，運動和情緒的應(yīng)激激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，興奮心臟α-和β-AR，主要激活β-AR，導(dǎo)致 IKr／hERG電流減少，使復(fù)極時間延長，誘發(fā)致命性室性心律失常。β1-AR阻滯劑美托洛爾廣泛應(yīng)用于臨床治療心衰，能減少死亡率和心源性猝死。

本研究發(fā)現(xiàn)心衰時β1-AR激活主要通過PKA途徑，抑制心室肌細(xì)胞IKr，提示β-AR阻滯劑的抗心律失常作用要部分歸功于它抑制β-腎上腺素對hERG通道的調(diào)控。腎上腺素的hERG通道調(diào)控是致心律失常的潛在機制，為抗心律失常治療開辟了一個新的途徑。

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