白藜蘆醇對(duì)K562白血病細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)分化的作用

趙燕娜，高瑞蘭，汪麗佩，余瀟苓，尹利明

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江杭州 310053）

白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在兒童和青年的惡性腫瘤中位居首位，其生物學(xué)特征是造血細(xì)胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發(fā)生障礙、異常分化的細(xì)胞大量增殖。目前臨床上常用的白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但其治療范圍僅限于急性早幼粒細(xì)胞白血病，應(yīng)用范圍局限，且有一定的毒副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用仍有爭(zhēng)議。由于天然化合物的毒性小，逐漸成為研究白血病分化的熱點(diǎn)。白黎蘆醇（resveratrol，Res），化學(xué)名 3，4’，5-三羥基-反 -均二苯代乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene），分子式C14H12O3，分子質(zhì)量：228.2，屬于非黃酮類多酚化合物［1］。對(duì)人體具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血小板聚集、保護(hù)心血管、抗炎、抗腫瘤［2-3］等多種生物學(xué)活性和藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)Res能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分化［4］，但是其機(jī)制尚不明確。

GATA-1是造血細(xì)胞紅系分化和成熟過程中的核心轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)紅系和巨核系分化。PU.1是另一個(gè)早期髓細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，主要在髓系和B淋巴細(xì)胞中表達(dá)。二者相互作用構(gòu)成一個(gè)造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其活性下降容易誘發(fā)骨髓的惡性轉(zhuǎn)化［5］。基于以上理論，本研究以具有多向分化潛能的K562白血病細(xì)胞株作為研究對(duì)象，觀察特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和PU.1，以及白血病細(xì)胞的分化相關(guān)抗原陽性細(xì)胞表達(dá)率，探討Res抑制K562細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制，為篩選抗白血病藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 K562細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，Res購自美國(guó)Sigma公司，IMDM培養(yǎng)基購自美國(guó) Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司，PE標(biāo)記的小鼠抗人CD11b、CD14、CD42b抗體、購自美國(guó)BD公司，GATA-1、PU.1抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin內(nèi)參抗體購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 半固體集落生成實(shí)驗(yàn) 計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106·L-1，進(jìn)行K562白血病細(xì)胞集落培養(yǎng)，分別加入白藜蘆醇使其終濃度為0、6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。培養(yǎng)體系為：IMDM培養(yǎng)液、30%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100U青／鏈霉素、0.3%瓊脂，接種于24孔板，每孔接種0.5 ml，重復(fù)3孔。置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。以大于40個(gè)細(xì)胞的聚合為一個(gè)K562白血病細(xì)胞集落，記錄白血病細(xì)胞集落數(shù)，并計(jì)算抑制率／%＝（對(duì)照組集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)）／對(duì)照組集落數(shù)×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化相關(guān)抗原陽性細(xì)胞的表達(dá)率 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1011·L-1，取50μl細(xì)胞懸液分別加入分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD42b單克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，上機(jī)檢測(cè)，每一個(gè)檢測(cè)標(biāo)本記錄10 000個(gè)細(xì)胞。DIVA軟件進(jìn)行陽性率的分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué) 收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L-1取 100μl，800 r·min-1離心 5 min甩片。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜。分別加一抗GATA-1、PU.1于4℃孵育（濕盒）過夜，二抗工作液（濕盒）37℃ 孵育30 min。DAB顯色10 min。蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞染色程度。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)GATA-1、PU.1蛋白表達(dá)量 收集細(xì)胞，提取蛋白。將40μg的總蛋白混合上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性，10%SDS-PAGE膠分離，蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，1%BSA封閉后，一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，ECL顯影，β-actin為內(nèi)參蛋白。用計(jì)算機(jī)熒光掃描系統(tǒng)掃描并記錄結(jié)果，以目的蛋白條帶×灰度值／（內(nèi)參蛋白×灰度值）的比值代表目的蛋白的表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Fig 1 Res inhibited the colon number of K562 cell in semi-solid culture assay（n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Expression of CD14，CD42b and CD11b in K562 cells by flow cytometryA：CD14；B：CD42b；C：CD11b

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，加藥組與對(duì)照組比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)K562細(xì)胞半固體集落生成的影響 不同劑量的白藜蘆醇處理K562細(xì)胞6d后，隨著劑量的增加，K562白血病細(xì)胞集落數(shù)明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，呈一定的劑量依賴關(guān)系（Fig 1）P＜0.01。白藜蘆醇 6.25、12.5、25、50和 100μmol·L-1組抑制率分別為13%±1.2%、28%±4%、53%±10%、63%±7%和90%±3%，均明顯高于陰性對(duì)照組，P＜0.05或P＜0.01。

2.2 白藜蘆醇提高K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原陽性細(xì)胞的表達(dá)率 白藜蘆醇處理K562細(xì)胞6 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞分化程度，結(jié)果顯示白藜蘆醇可誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD42b、CD11b和CD14的表達(dá)陽性率均明顯高于對(duì)照組，且呈一定的劑量依賴關(guān)系（Fig 2）。

2.3 白藜蘆醇對(duì)K562細(xì)胞中 GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)水平的影響 不同濃度白藜蘆醇處理K562細(xì)胞6d后，細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示隨著劑量的增加GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（Fig 3，4）。Western blot法的結(jié)果與細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果基本一致，白藜蘆醇處理后的K562細(xì)胞蛋白條帶的灰度值明顯高于對(duì)照組，P＜0.05或P＜0.01（Fig 5）。

Fig 3 Expressions of GATA-1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

3 討論

Fig 4 Expressions of PU.1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

Fig 5 Expression of GATA-1 and PU.1 in K562 cells was anayzed with Western blot（A）K562 cells were treated with Res for 6 days，and the cell lysates were subjected to Western blot analysis for GATA-1 and PU.1.Beta-actin served as an equal loading control.Histograms（B）showed the relative expression of GATA-1 and PU.1（normalized to actin）as compared to the vehicle-treated cell.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

目前臨床上常用的白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但因其應(yīng)用范圍局限，毒副作用大，長(zhǎng)期應(yīng)用仍有爭(zhēng)議。人髓系白血病K562細(xì)胞株在一定條件下可向紅系、粒-單系和巨核系細(xì)胞分化，是研究白血病細(xì)胞增殖與分化的理想細(xì)胞模型。白黎蘆醇作為新興綠色保健藥和抗癌藥，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)［6-8］，白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和自噬。Yan等［9］采用白藜蘆醇作用于K562白血病細(xì)胞株后，檢測(cè) GPA、HBA1、HBB和 γ-珠蛋白的表達(dá)，觀察白藜蘆醇誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化。本實(shí)驗(yàn)以白血病細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和PU.1蛋白及分化相關(guān)抗原為觀察指標(biāo)，觀察白藜蘆醇誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系、粒系和巨核系分化的作用。利用其多向分化的能力，主要觀察Res抑制增殖，誘導(dǎo)白血病分化作用。結(jié)果顯示白藜蘆醇明顯提高K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b、粒-單系細(xì)胞分化抗原CD14、巨核系細(xì)胞分化抗原CD42b及紅系特異性核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1蛋白和轉(zhuǎn)錄因子PU.1蛋白的表達(dá)。提示白藜蘆醇可能具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞向紅系、粒系和巨核系分化的作用，其中誘導(dǎo)紅系分化作用尤為明顯。白藜蘆醇誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制仍需深入研究，為白藜蘆醇今后的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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