新型免疫抑制劑SYL934的抗皮膚移植排斥反應(yīng)研究

金 晶，張海婧，汪小澗，周琬琪，扈金萍，尹大力，陳曉光

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050）

皮膚移植是救治大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷的關(guān)鍵措施之一，雖然自體皮膚移植是覆蓋皮膚缺損的最好方法，但針對自體皮源不足的大面積燒傷患者，異體皮膚移植仍然是目前較好的治療方法。由于異體皮膚在移植后會因機體的排斥反應(yīng)而不能長期存活，因此臨床上通常會采用免疫抑制劑來進行抗排異治療。傳統(tǒng)的免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A，環(huán)磷酰胺等，主要通過抑制淋巴細胞生長從而達到抑制免疫的目的，長期應(yīng)用還會造成諸多包括肝腎毒性在內(nèi)的不良反應(yīng)，因此尋找全新作用機制的免疫抑制劑是抗異體皮膚移植排異臨床治療的迫切需要。

鞘氨醇-1-磷酸 1型受體（sphingosine-1-phosphate receptor1，S1P1）是鞘胺醇-1-磷酸受體家族的成員之一，廣泛表達于哺乳動物淋巴細胞表面，也是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)淋巴細胞運輸?shù)男掳悬c［1］。研究表明，S1P1能夠調(diào)控淋巴細胞流出胸腺及次級淋巴器官從而進入血液循環(huán)。無論直接敲除S1P1或通過誘導(dǎo)S1P1內(nèi)陷降低細胞膜表面的受體表達，均會使淋巴細胞滯留于胸腺和次級淋巴器官，進而導(dǎo)致外周血中淋巴細胞數(shù)量的降低，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)［2-3］。芬戈莫德（fingolimod，F(xiàn)TY720）是首個發(fā)現(xiàn)的前藥類S1P1激動劑，在體內(nèi)會被SHPK2磷酸化，變成活性磷酸酯形式FTY720-P，繼而通過作用于淋巴細胞表面的S1P1受體，導(dǎo)致受體發(fā)生內(nèi)陷及后續(xù)的泛素化降解，發(fā)揮免疫抑制作用［4-6］。正是這種獨特的作用機制，使得FTY720在抗移植排斥治療方面的應(yīng)用備受矚目［7-10］。但由于FTY720并非S1P1特異性激動劑，在激動S1P1的同時也激動了該受體家族另一亞型——S1P3，在臨床應(yīng)用中會導(dǎo)致如心動過緩、血壓增高等不良反應(yīng)的發(fā)生［11-12］，至今仍未能應(yīng)用于抗移植排斥反應(yīng)的治療。因此，開發(fā)針對S1P1受體的選擇性激動劑，是當(dāng)前藥學(xué)工作者們的研究熱點。

SYL934是根據(jù)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的基本原理，通過化學(xué)合成的具有二苯醚骨架的氨基丙二醇類前藥類選擇性S1P1受體激動活性化合物。本研究擬應(yīng)用體外均相時間分辨熒光檢測、SD大鼠外周血淋巴細胞檢測和SD大鼠心率檢測等方法，以及小鼠皮膚移植模型，考察 SYL934及其活性磷酸酯SYL934-P的體內(nèi)外生物活性。

1 材料

1.1 試劑、藥品及器材 SYL934，SYL934-P，F(xiàn)TY720，F(xiàn)TY720-P，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所尹大力研究員課題組提供。DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），特級胎牛血清（美國Hyclone公司），HTRF-IP試劑盒（法國Cisbio公司）。二甲基亞砜（DMSO，北京化工廠），Envision儀（美國PE公司），MEK-7222K血球分析儀（日本Nihon Kohden公司），智能無創(chuàng)血壓測定計-鼠儀（日本Softron公司）。

1.2 細胞株 過表達人S1P1的CHO細胞株（hS1P1-CHO）和過表達人 S1P3的 CHO細胞株（hS1P3-CHO），購自美國Multispan公司。

1.3 實驗動物 SPF級♂ Sprague-Dawley（SD）大鼠，180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK-（京）2007-001。SPF級♂Sprague-Dawley（SD）大鼠，180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK-（京）2006-0009。SPF級♂ C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠，18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK（京）2009-0007。

2 方法

2.1 HTRF-IP1檢測 參照Cisbio公司的HTRFIP1試劑盒操作步驟，將hS1P1-CHO細胞及hS1P3-CHO細胞重懸于1×Stimulation Buffer（含 LiCl），以70 000個細胞／孔的密度鋪于384孔板，每孔7μl。加入7μl不同濃度的待測化合物，37℃，5%CO2孵育2 h，同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入3μl用Lysis Buffer稀釋的IP1-d2，再加入3μl Lysis Buffer稀釋的Ab-Cryp，室溫孵育1 h。Envision檢測波長665 nm與615 nm的吸光度。將化合物665／615比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的IP-1濃度。以IP-1濃度值與對應(yīng)化合物濃度的Log值，進行Nonlinear least squares fit（log agonist vs.response-Variable slope），得到EC50值（軟件 Graph Pad 5.0）。

2.2 大鼠外周血淋巴細胞計數(shù) ♂ SD大鼠25只，隨機分為5組：溶劑對照組 （給予雙蒸水）、SYL934 5 mg·kg-1劑量組，SYL934 10 mg·kg-1劑量組，SYL934 15 mg·kg-1劑量組以及FTY720 10 mg·kg-1劑量組，單次灌胃給藥。分別于給藥前（0 h），給藥后2、4、6、8、12及 24 h尾靜脈取血，通過全自動血細胞計數(shù)儀計數(shù)血液中淋巴細胞數(shù)量。外周血平均淋巴細胞數(shù)量用ˉx±s表示，并以降至最低時間點的淋巴細胞數(shù)量計算最大淋巴細胞降低百分率△%?！?＝（給藥前淋巴細胞數(shù)-給藥后最低淋巴細胞數(shù)）／給藥前淋巴細胞數(shù)×100%。不同時間點淋巴細胞降低百分率／%＝（給藥前淋巴細胞數(shù)-給藥后不同時間點淋巴細胞數(shù)）／給藥前淋巴細胞數(shù)×100%

2.3 大鼠心率測定 ♂SD大鼠15只，隨機分為3組：溶劑對照組 （給予雙蒸水）、SYL934 10 mg·kg-1劑量組以及FTY720 10 mg·kg-1劑量組，單次灌胃給藥。分別于給藥前（0 h），給藥后0.5、1、3、6、8及24 h測定大鼠心率，每只動物重復(fù)測定3次。測定結(jié)果以ˉx±s表示，并以降至最低時間點的心率值最大心率降低百分率△%?！?＝（給藥前心率-給藥后最低計算心率）／給藥前心率×100%。不同時間點心率降低百分率%＝（給藥前心率-給藥后不同時間點心率）／給藥前心率×100%

2.4 小鼠皮膚移植后皮片成活檢測 取C57BL／6小鼠及BALB／c小鼠各21只，腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg·kg-1）麻醉后，取背中部靠右側(cè)處作為手術(shù)區(qū)，將其體毛剃掉，以75%乙醇及碘伏消毒，以眼科剪剪除全層皮膚形成1 cm×1 cm的創(chuàng)面，剪除皮片的筋膜層，以生理鹽水沖洗后作為同種異體皮膚移植備用，將其創(chuàng)面作為移植床。從生理鹽水中取出小鼠背部皮片作為移植物平鋪于植床，用創(chuàng)可貼和醫(yī)用膠布通過胸腹部環(huán)繞包扎，適當(dāng)加壓，使皮片和植床緊密接觸。C57BL／6小鼠與BALB／c小鼠進行雙向移植。將42只小鼠隨機分為3組，皮膚移植溶劑對照組（給予雙蒸水），SYL934給藥組（2 mg·kg-1）以及 SYL934給藥組（4 mg·kg-1），灌胃給藥，每日1次，每組C57BL／6小鼠與BALB／c小鼠各7只（共14只）。每天觀察小鼠皮膚生長情況，直至實驗結(jié)束。術(shù)后4 d內(nèi)如有皮片移位或脫落則認為手術(shù)失敗，不記入實驗數(shù)據(jù)中。術(shù)后第7天拆除包扎，觀察移植物顏色、硬度、結(jié)癡和脫落情況，以皮片變黑變硬、結(jié)癡脫落定為排斥終點。若植皮與宿主的背部愈合，色澤一致，無炎癥和充血，有毛的皮膚毛發(fā)生長良好，則認為未發(fā)生排斥反應(yīng)。50%以上皮片結(jié)痂、變硬、壞死、脫落作為排斥標(biāo)準(zhǔn)。觀察指標(biāo)包括：①皮膚血供情況：移植皮膚色紅，皮下毛細血管血液循環(huán)良好，表明移植皮膚存活；移植皮膚顏色變暗，發(fā)黃、褐，或者變黑，表明有排斥反應(yīng)，移植皮膚死亡；②毛發(fā)生長情況：移植皮膚有新的毛發(fā)生長，毛發(fā)光澤明亮，說明移植皮膚生長良好，移植皮膚存活；沒有毛發(fā)生長，或生長出來的毛發(fā)顏色變暗，失去光澤，或毛發(fā)脫落，表明有排斥反應(yīng)，移植皮膚死亡。計算移植皮片的存活率。Survival rate／%＝移植皮片存活的動物數(shù)／動物總數(shù)×100%

3 結(jié)果

3.1 SYL934-P對S1P1和S1P3受體的體外活性研究 SYL934是根據(jù)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的基本原理，通過化學(xué)合成的具有二苯醚骨架的氨基丙二醇類前藥類化合物，為了在體外水平對其進行檢測，我們同時通過合成手段構(gòu)建了其激動受體的磷酸酯形式SYL934-P。結(jié)構(gòu)見Fig 1。HTRF-IP1是近年來國際上檢測G蛋白偶聯(lián)受體（Gq）下游通路活性的常用方法，主要通過檢測細胞內(nèi)產(chǎn)生的IP1含量，從而反應(yīng) Gq通路的活化過程［13-15］。研究結(jié)果顯示SYL934-P對S1P1受體有較強的激動活性（EC50＝50 nmol·L-1），作用強度與FTY720-P在相同數(shù)量級（EC50＝16 nmol·L-1）。而 SYL934-P對 S1P3的激動作用很弱（EC50＝1148 nmol·L-1），遠低于FTY720-P（EC50＝55 nmol·L-1），提示 SYL934-P對S1P1具有較高的選擇性激動作用。結(jié)果見Tab 1。

Fig 1 Chemical structure of FTY720，F(xiàn)TY720-P，SYL934 and SYL934-P

Tab 1 HTRF-IP1 assay of SYL934-P and FTY720-P on hS1P1-CHO and hS1P3-CHO cells（±s）

Tab 1 HTRF-IP1 assay of SYL934-P and FTY720-P on hS1P1-CHO and hS1P3-CHO cells（±s）

a EC50 is the mean of three experimental determinations.

EC50（nmol·L-1）a S1P1 S1P3 Selectivity（S1P1 vs S1P3）SYL934-P 50±8 1148±37 23 FTY720-P 16±5 55±15 3

3.2 SYL934降低大鼠外周血淋巴細胞作用檢測SD大鼠外周血淋巴細胞檢測結(jié)果顯示，單次灌胃給予SD大鼠不同劑量的SYL934，大鼠外周血淋巴細胞數(shù)量出現(xiàn)明顯降低。其中，單次給予SD大鼠5 mg·kg-1SYL934 2，4，6，8，12和 24 h，淋巴細胞降低百分率分別為 22%，29%，37%，53%，67%和61%。單次給予SD大鼠10 mg·kg-1的SYL934，相應(yīng)時間點淋巴細胞降低百分率分別為44%，46%，42%，63%，68%和67%。單次給予SD大鼠15 mg·kg-1的SYL934，相應(yīng)時間點的淋巴細胞降低百分率分別為37%，44%，54%，64%，75%和66%。3個劑量組淋巴細胞最低點均出現(xiàn)在給藥后12 h，降低百分率隨給藥劑量增加呈一定程度的增加，分別為67%，68%和75%，量效關(guān)系較好。單次灌胃給予SD大鼠10 mg·kg-1的陽性藥FTY720后，大鼠外周血淋巴細胞數(shù)量亦出現(xiàn)明顯降低。給藥后2，4，6，8，12和 24 h，淋巴細胞降低百分率分別為36%，32%，44%，54%，54%和64%。淋巴細胞最低點出現(xiàn)在給藥后24 h，降低百分率達64%，與相同劑量的SYL934基本相當(dāng)。結(jié)果見Tab 2和Fig 2。

Fig 2 Effect of SYL934 on number of blood peripheral lymphocytes of SD rats

3.3 SYL934對大鼠心率的影響 10 mg·kg-1SYL934單次灌胃給予 SD大鼠后 0.5，1，3，6，8和24 h，大鼠心率降低百分率分別為 -9%，-7%，3%，2%，-5%和-5%，最大心率降低百分率為3 h時間點的3%，與灌胃給予溶劑對照的SD大鼠的最大心率降低百分率（3%）相當(dāng)，呈正常波動。而10 mg·kg-1FTY720口服給予SD大鼠后0.5，1，3，6，8和24 h，大鼠心率降低百分率分別為1%，9%，20%，18%，14%和17%，最大心率降低百分率為3 h時間點的20%，明顯高于溶劑對照組與等劑量的SYL934組。結(jié)果見Tab 3和Fig 3。

Tab 2 Effect of SYL934 on peripheral blood lymphocytes（PBL）in SD rats±s，n＝5）

Tab 2 Effect of SYL934 on peripheral blood lymphocytes（PBL）in SD rats±s，n＝5）

△／% ＝（the number of PBL before administration of compounds-the lowest number of PBL after administration of compounds）／the h number of PBL before administration of compounds×100%

Group Dose／mg·kg-1-1／%Control - 5.5±1.0 5.4±1.0 6.5±0.7 6.5±1.3 5.1 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h △Number of PBL／×109·L±0.9 2.3±0.8 1.8±0.3 64±0.9 5.3±2.1 6.1±0.8 7 SYL934 5 5.1±1.0 4.0±1.4 3.6±0.9 3.2±0.5 2.4±0.7 1.7±0.5 2.0±0.3 67 10 5.7±0.5 3.2±0.8 3.1±0.9 3.3±1.5 2.1±0.4 1.8±0.8 1.9±0.6 68 15 5.9±1.0 3.7±0.4 3.3±1.5 2.7±0.3 2.1±0.6 1.5±0.4 2.0±0.7 75 FTY720 10 5.0±1.1 3.2±0.7 3.4±1.3 2.8±0.8 2.3

Tab 3 Effect of SYL934 on heart rate in SD rats（±s，n＝5）

Tab 3 Effect of SYL934 on heart rate in SD rats（±s，n＝5）

△／% ＝（the heart rate before administration of compounds-the lowest heart rate after administration of compounds）／the heart rate before administration of compounds×100%

Group Dose／mg·kg-1／%Control - 413±20 409±33 420±17 417±36 401±27 4 0 h 0.5 h 1 h 3 h 6 h 8 h 24 h △Heart rate／min 41±30 329±27 20 07±29 404±39 3 SYL934 10 346±17 376±29 369±20 337±19 338±25 362±25 365±37 3 FTY720 10 396±22 392±14 361±31 318±16 325±22 3

Fig 3 Effect of SYL934 on heart rate of SD rats

3.4 SYL934對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時間的影響 灌胃給予小鼠SYL934能夠明顯增加小鼠異體移植皮片的存活率。在移植術(shù)后的d 7，對照組的14只動物，只有1只動物的移植皮片存活，皮片存活率僅為7%。而SYL934 2 mg·kg-1劑量組及4 mg·kg-1劑量組的皮片存活率分別為36%和71%，均較對照組有明顯增加。結(jié)果見Tab 4。

Tab 4 Inhibition effect of SYL934 on skin transplantation rejection from C57BL／6 and Balb／c mice

4 討論

SYL934是根據(jù)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的基本原理，通過化學(xué)合成的具有二苯醚骨架的氨基丙二醇類前藥類化合物。為了研究其藥理作用，我們首先應(yīng)用了均相時間分辨熒光技術(shù)（HTRF-IP1法），對其體外活性進行了初步評價。研究結(jié)果表明，SYL934的活性磷酸酯形式SYL934-P能夠特異性地激動S1P1受體，作用強度與陽性藥FTY720-P在相同數(shù)量級，而對S1P3的激動作用較弱，半數(shù)有效濃度為1 148 nmol·L-1，遠高于 FTY720-P的 55 nmol·L-1。提示在體外，SYL934-P具有較好的受體選擇性。

體內(nèi)SD大鼠外周血淋巴細胞檢測研究顯示，SYL934能夠明顯降低SD大鼠外周血淋巴細胞水平。5、10及15 mg·kg-1的SYL934單次灌胃給藥，最大淋巴細胞降低百分率分別為67%，68%和75%，與相同劑量的陽性藥FTY720基本相當(dāng)，且具有較好的量效關(guān)系。提示SYL934在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為SYL934-P（SYL934的活性磷酸酯形式）后，通過激動淋巴細胞表面的S1P1受體，降低外周血中淋巴細胞數(shù)量，發(fā)揮了免疫抑制效應(yīng)。

體內(nèi)SD大鼠心率檢測結(jié)果表明，單次灌胃給予SD大鼠10 mg·kg-1的SYL934對大鼠的心率影響較小，最大心率降低百分率（3%）與溶劑對照最大心率降低百分率（3%）基本相當(dāng)，處于正常心率波動范圍。而單次灌胃給予SD大鼠相同劑量的FTY720，心率出現(xiàn)了明顯降低，最大心率降低百分率為20%，明顯高于溶劑對照組與SYL934組。提示可能與 FTY720同時激動 S1P1與 S1P3，而SYL934只選擇性激動S1P1相關(guān)。

小鼠異體皮膚移植實驗結(jié)果表明，每天灌胃給予2、4 mg·kg-1的SYL934，能夠明顯提高移植皮片的存活率。對照組動物在術(shù)后7 d的皮片存活率僅為7%，而2 mg·kg-1SYL934劑量組的皮片存活率為36%，4 mg·kg-1SYL934劑量組皮片存活率則高達71%。提示，SYL934能夠通過誘導(dǎo)淋巴細胞歸巢發(fā)揮免疫抑制作用，降低皮膚移植的免疫排斥反應(yīng)，提高移植皮片的存活率。

綜上所述，作為一個新型結(jié)構(gòu)的S1P1選擇性激動劑，SYL934在體內(nèi)展現(xiàn)了良好的誘導(dǎo)淋巴細胞歸巢作用，對心率沒有影響，并且能夠明顯提高小鼠皮膚移植模型中移植皮片的存活率，有望應(yīng)用于皮膚移植排斥反應(yīng)的治療。

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