分泌型簇蛋白在肺動脈高壓大鼠中的表達(dá)變化

劉曉艷，孟劉坤，李 君，魏英杰

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國家心血管病中心阜外心血管病醫(yī)院心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床-病理綜合征，臨床表現(xiàn)為右心室后負(fù)荷增加，活動耐力下降，嚴(yán)重者可發(fā)生右心衰竭而死亡，是最嚴(yán)重的具有潛在致命性的慢性肺循環(huán)疾病，已成為當(dāng)今重要的國際性醫(yī)療保健問題［1］。肺血管重構(gòu)是PAH的主要病理改變，表現(xiàn)為肌性動脈肌層增加，無肌性動脈出現(xiàn)肌層及新生內(nèi)膜和叢狀病變的形成。其中，肺血管壁細(xì)胞的過度生長在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用［2］。

分泌型簇蛋白（secretory clusterin，sCLU）是一種細(xì)胞保護(hù)性因子，具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，因此我們推測它可能參與了肺血管重構(gòu)的過程［3］。本研究旨在闡明sCLU在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織和血漿中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步探討肺血管重構(gòu)的機制及尋找PAH新的生物標(biāo)志物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 MCT（Sigma公司），TRIzol（Invitrogen公司），AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），PCR引物（TaKaRa生物工程有限公司），抗 sCLU抗體（Millipore公司），抗 GAPDH抗體（Sigma公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)公司），大鼠sCLU酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（R＆D公司），Power SYBR green PCR master mix（ABI公司）。

1.2 動物模型制備及標(biāo)本留取 30只SPF級♂SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質(zhì)量260～300 g（8周齡），隨機分為對照組（CON，n＝6）和MCT組（n＝24）。MCT組給予腹腔注射MCT 60 mg·kg-1，對照組給予等體積生理鹽水注射。分別在注射MCT后的1（n＝6）、2（n＝6）、3（n＝6）、4（n＝6）周用右心導(dǎo)管法檢測肺血流動力學(xué)指標(biāo)（右心室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓）并計算右室肥厚指數(shù)：［右心室游離壁／（左心室+室間隔）］，以評估PAH的程度；收取動物的肺組織，一部分迅速存放于液氮中，準(zhǔn)備用于Western blot和PCR檢測，余下部分用中性福爾馬林固定后石蠟包埋制成蠟塊，準(zhǔn)備用于免疫組織化學(xué)（immunohitochemistry，IHC）檢測；同時留取動物的血漿標(biāo)本，分裝后存于-80℃，準(zhǔn)備用于ELISA檢測。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time PCR，RT-PCR） 取肺組織約100 mg，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測sCLU mRNA水平的表達(dá)變化［4］。引物序列如下：sCLU：5′-CCACAGGATGCCTGAAGATGAA-3′，5′-AGGTTA GCCTGGGCAGGATTG-3′；GAPDH：5′-GGCACAGTC AAGGCTGAGAATG-3′，5′-ATGGTGGTGAAGACGCC AGTA-3′。

1.4 Western blot 提取肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各樣本取50μg總蛋白，100℃加熱5 min變性，4%～12%的預(yù)制膠電泳分離蛋白質(zhì)；經(jīng)半干轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用50 g·L-1的脫脂奶粉封閉1 h，4℃搖床孵育過夜；洗膜緩沖液（tris-buffered-saline with Tween，TBST）漂洗后接二抗，室溫孵育1 h；TBST再次漂洗后，化學(xué)顯色。一抗?jié)舛确謩e為抗sCLU 1∶1 000，抗GAPDH 1∶2 000；二抗?jié)舛葹?∶2 000。

1.5 IHC 取制作好的蠟塊，切片，貼片后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗3次，每次5 min，高壓抗原修復(fù)；以體積分?jǐn)?shù)為0.003的Triton X 100孵育20 min以破細(xì)胞膜；山羊血清封閉1 h后加入抗sCLU一抗（1∶400），4℃孵育24 h；PBS洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶500），室溫孵育2 h；PBS洗 3次，每次 5 min，加入ABC復(fù)合物，室溫孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min，用蒸餾水迅速沖3次；加入顯色液（DAB-H2O2），進(jìn)行IHC顯色，控制好顯色時間，一般不超過30 min，PBS終止顯色；梯度酒精脫水，封片，拍照。

1.6 ELISA 大鼠血漿中sCLU濃度的檢測使用R＆D公司的試劑盒，按照說明書中操作步驟進(jìn)行，試驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以ˉx±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用student’s t檢驗。

Fig 1 Changes of haemodynamics and right ventricular hypertrophic index±s，n＝6）RVSP：Right ventricular systolic pressure；PASP：Pulmonary arterial systolic pressure；mPAP：Mean pulmonary arterial pressure；RVHI：Right ventricular hypertrophic index.**P＜0.01 vs control group.

2 結(jié)果

2.1 動物模型PAH程度的評價 MCT組大鼠的右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和右室肥厚指數(shù)均較對照組大鼠明顯升高，并隨MCT注射時間的延長而逐漸升高（Fig 1），說明在此動物模型中形成了PAH的疾病狀態(tài)，并且PAH的程度隨時間延長而逐漸進(jìn)展。

2.2 sCLU的mRNA在PAH大鼠肺組織中的表達(dá)變化 RT-PCR的結(jié)果顯示，與對照組相比，sCLU的mRNA在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織中呈時間依賴性地升高，即注射MCT后2周時開始明顯升高，為對照組的2.1倍，4周時達(dá)到最高，為對照組的3.1倍（Fig 2）。

Fig 2 Changes of sCLU mRNA in MCT induced PAH rat lungs（xˉ±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.3 sCLU的蛋白水平在PAH大鼠肺組織中的表達(dá)變化 Western blot的結(jié)果顯示，sCLU的蛋白水平在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織中的表達(dá)變化與其mRNA水平變化趨勢一致，即隨PAH的進(jìn)展而逐漸升高，注射MCT后2周時開始升高，為對照組的1.6倍，4周時最高，為對照組的2.6倍（Fig 3）。

Fig 3 Changes of sCLU protein in MCT induced PAH rat lungs（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.4 sCLU在PAH大鼠肺動脈中的定位情況IHC染色的結(jié)果顯示，sCLU在正常大鼠的肺小動脈中幾乎不表達(dá)，而在MCT處理組大鼠發(fā)生了重構(gòu)的肺小動脈中表達(dá)明顯升高，并且sCLU主要定位于肺小動脈的胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中（Fig 4）。

2.5 sCLU在PAH大鼠血漿中濃度的變化 ELISA檢測的結(jié)果顯示，sCLU在大鼠血漿中的濃度亦隨注射MCT時間的延長而逐漸升高，與肺組織中sCLU mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化相一致（Fig 5）。

Fig 5 Changes of sCLU plasma concentration in MCT induced PAH（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.6 sCLU的血漿濃度與肺血流動力學(xué)指標(biāo)及右室肥厚指數(shù)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，sCLU的血漿濃度與右室收縮壓（r2＝0.537，P＜0.05），肺動脈收縮壓（r2＝0.621 2，P＜0.05），平均肺動脈壓（r2＝0.505 8，P＜0.05）及 右室肥厚指數(shù)（r2＝0.633 7，P＜0.05）均呈正相關(guān)（Fig 6）。這說明，血漿中sCLU的濃度與PAH的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示sCLU有可能是反映PAH嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物（Fig 6）。

Fig 6 Correlation of sCLU plasma concentration with pulmonary haemodynamics index and right ventricular hypertrophic indexRVSP：right ventricular systolic pressure；PASP：pulmonary arterial systolic pressure，mPAP：mean pulmonary arterial pressure；RVHI：right ventricular hypertrophic index.

3 討論

簇蛋白（clusterin，CLU）是一種普遍存在于哺乳動物組織和體液中的異二聚體硫化糖蛋白，曾被稱為載脂蛋白 J（apolipoprotein J，Apo J）、硫化糖蛋白-2（sulfatedglycoprotein-2）等［3］。CLU的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后剪接形成兩個轉(zhuǎn)錄本，這兩個轉(zhuǎn)錄本經(jīng)翻譯后分別形成分泌型CLU（secretory clusterin，sCLU）和核型 CLU（nuclear clusterin，nCLU）［5-6］。研究表明sCLU在細(xì)胞受到各種刺激時產(chǎn)生，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抵抗細(xì)胞凋亡的作用，是一種細(xì)胞保護(hù)性因子。而nCLU的功能與sCLU相反，主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用?；赑AH肺血管重構(gòu)過程中肺血管壁細(xì)胞過度生長的特點與sCLU的功能相吻合，我們推測，sCLU可能在PAH大鼠的肺組織和血漿中的表達(dá)發(fā)生了變化，并參與了肺血管重構(gòu)的過程。

MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型是目前PAH研究中應(yīng)用最多的模型之一，并且基于此模型發(fā)現(xiàn)了PAH的眾多細(xì)胞分子機制，是一種可信賴的PAH動物模型［7-10］。我們的結(jié)果表明，在注射MCT后大鼠的肺血流動力學(xué)指標(biāo)和右室肥厚指數(shù)均呈時間依賴性地明顯升高，表明本研究中此模型構(gòu)建得非常成功。在此模型基礎(chǔ)上，我們探討了sCLU在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織和血漿中的表達(dá)變化。

本研究結(jié)果顯示，sCLU的mRNA和蛋白水平在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織中明顯升高，呈時間依賴性，并且sCLU主要定位于發(fā)生了重構(gòu)的肺小動脈管壁細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中。這提示我們，sCLU可能在肺血管重構(gòu)過程中發(fā)揮著重要的作用?；趕CLU的細(xì)胞保護(hù)性作用，我們推測它可能是通過促進(jìn)肺血管壁細(xì)胞的增殖和凋亡抵抗來參與肺血管重構(gòu)的，但是其確切的機制尚需進(jìn)一步的研究。

ELISA的結(jié)果表明，sCLU的血漿濃度在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠中亦隨注射MCT時間的延長而逐漸升高，并且與肺血流動力學(xué)指標(biāo)和右室肥厚指數(shù)均呈正相關(guān)，這表明，sCLU可能是反映PAH嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。當(dāng)然，此假設(shè)尚需在PAH病人中進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗證。

總之，本研究證明sCLU在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織和血漿中的表達(dá)隨PAH的進(jìn)展而逐漸升高，它可能通過促進(jìn)肺血管壁細(xì)胞的生長而參與了肺血管重構(gòu)的過程，此外，sCLU可能是反映PAH嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。

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