天麻素預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的可能機(jī)制

位 凱，王 飛，張 瑾，李 珍，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)其病理機(jī)制主要與氧自由基過多、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)［1］。天麻是一種具有多種功效的中藥，天麻素(4-羥甲基苯甲醇-β-D吡喃葡萄糖甙)是其活性最高的有效單體，具有改善神經(jīng)系統(tǒng)血供、鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥的作用［2］，還具有降低外周血管阻力和血壓的作用［3－4］。該課題組前期研究［5］顯示天麻素預(yù)處理能明顯減輕大鼠MIRI，可能與減輕MIRI時(shí)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，在炎癥反應(yīng)中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)起主要作用，因此該實(shí)驗(yàn)在原有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從炎癥因子變化的角度進(jìn)一步探討天麻素預(yù)處理減輕大鼠MIRI作用的可能機(jī)制。前期研究［5］還表明天麻素可能會(huì)抑制Ca2+超載，這種作用是否與肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+－ATPase，SERCA)有關(guān)，也是本研究要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 60只健康成年SPF級(jí)SD大鼠(安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘，體重(230±10)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組，MIRI組，0.1、0.2 和0.4 g/kg天麻素組。

1.2 主要試劑及儀器 天麻素(批號(hào):2010081，純度:99.2%，江蘇寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司);TNF-α、IL-6、SERCA檢測(cè)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司);其他試劑均為分析純;BL-420E生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)、動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司);SpectraMax190酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠MIRI模型制備 于每日上午9∶00對(duì)各組大鼠灌胃給藥:假手術(shù)組與MIRI組均給予生理鹽水灌胃，天麻素組分別給予0.1、0.2和0.4 g/kg的天麻素灌胃，連續(xù)7 d。于第7天灌胃后建立大鼠MIRI模型:用10%水合氯醛以3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉，做氣管插管，連接呼吸機(jī)(呼吸頻率60次/min，潮氣量11 ml/次，呼 －吸之比為1∶2)。四肢皮下連接電極，標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)接BL-420E生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)連續(xù)記錄心電圖。在左側(cè)第3～4肋間隙之間鈍性分離肌肉，暴露心臟，在左心耳下緣處以冠狀靜脈主干為標(biāo)志，用5-0號(hào)帶針無創(chuàng)縫合線進(jìn)針，向肺動(dòng)脈圓錐方向出針，連同直徑2 mm塑料管一起打活結(jié)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，缺血成功的標(biāo)志為Ⅱ?qū)?lián)R波增寬，ST段抬高，缺血30 min后，松開結(jié)扎線，再灌注2 h，再灌注成功的標(biāo)志為抬高的ST段下降，S波幅值恢復(fù)50%以上。假手術(shù)組術(shù)中只穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。

1.3.2 血清及心肌組織檢測(cè) 各組于缺血再灌注2 h后分別從腹主動(dòng)脈取血約4 ml，以3 500 r/min離心10 min，得到大鼠血清，分裝，－20℃冰箱儲(chǔ)存;并取各組結(jié)扎線下方左心室前壁心肌組織，切取一部分心肌組織于－80℃冰箱儲(chǔ)存，剩余部分置于4%福爾馬林溶液中固定，將用于形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。按試劑盒說明書檢測(cè)血清及心肌組織中TNF-α、IL-6和SERCA水平，用酶標(biāo)儀測(cè)各組吸光度值。

1.3.3 心肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取左心室前壁心肌組織進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 天麻素預(yù)處理對(duì)血清及心肌組織中TNF-α的影響 與假手術(shù)組相比，MIRI組血清及心肌組織中TNF-α含量均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，說明MIRI時(shí) TNF-α參與其中。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組血清及心肌組織的TNF-α含量略減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組血清及心肌組織的TNF-α含量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明天麻素預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注時(shí)TNF-α的釋放;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表1。

表1 各組大鼠血清及心肌組織中TNF-α含量比較(n=12，±s)

表1 各組大鼠血清及心肌組織中TNF-α含量比較(n=12，±s)

與假手術(shù)組比較:＊＊P ＜0.01;與 MIRI組比較:##P ＜0.01

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2.2 天麻素預(yù)處理對(duì)血清及心肌組織中IL-6的影響 與假手術(shù)組相比較，MIRI組血清及心肌組織中的IL-6含量均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，說明MIRI時(shí)IL-6參與其中。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組血清及心肌組織的IL-6含量略減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組血清的IL-6含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，心肌組織中的IL-6含量亦減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明天麻素預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注時(shí)IL-6的釋放;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表2。

表2 各組大鼠血清及心肌組織中IL-6含量比較(n=12，±s)

表2 各組大鼠血清及心肌組織中IL-6含量比較(n=12，±s)

與假手術(shù)組比較:＊＊P＜0.01;與MIRI組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

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2.3 天麻素預(yù)處理對(duì)心肌組織中SERCA的影響

與假手術(shù)組相比較，MIRI組心肌組織中的SERCA含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明MIRI時(shí)心肌組織中SERCA含量減少。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組心肌組織中的SERCA含量略增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組心肌組織中的SERCA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明天麻素預(yù)處理可以增加心肌缺血再灌注時(shí)SERCA的含量;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA含量比較(n=12，±s)

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA含量比較(n=12，±s)

與假手術(shù)組比較:＊＊P＜0.01;與MIRI組比較:##P＜0.01

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2.4 天麻素預(yù)處理對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 各組心肌組織經(jīng)HE染色后可見:假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，胞膜完整，界限清晰，胞質(zhì)、胞核著色均勻，見圖1A;MIRI組心肌細(xì)胞排列不整齊，界限不清，有明顯水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，可見紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1B，這從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明模型制備成功;0.1 g/kg天麻素組排列不整齊，界限不清，水腫較明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張，可見紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1C;而0.2、0.4 g/kg天麻素組心肌細(xì)胞排列較整齊，橫紋較清晰，界限較清楚，無明顯水腫，僅有少量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1D、E。從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明天麻素預(yù)處理后可以減輕MIRI時(shí)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

MIRI是心肌在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象，是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其中炎癥反應(yīng)貫穿于心肌細(xì)胞損傷的全過程［6］。本課題組前期研究［5］顯示天麻素預(yù)處理后能減輕MIRI時(shí)心肌組織間隙炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，說明天麻素能抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)，在炎癥反應(yīng)中TNF-α和IL-6起到主要作用，那么天麻素是否通過影響TNF-α和IL-6來實(shí)現(xiàn)抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)?因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠血清及心肌組織中炎性因子TNF-α、IL-6的含量變化來進(jìn)一步研究天麻素預(yù)處理對(duì)MIRI的作用。

TNF-α是一種重要的細(xì)胞炎癥因子，心肌是其作用的靶器官［7］，通過多種機(jī)制參與MIRI過程，不僅可以激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而且還可以促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生、活化中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷［8］。IL-6被稱為白介素家族的核心成員，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［9］，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)流入缺血的心肌組織，刺激中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞表面分別表達(dá)CD11b/CD18及細(xì)胞間黏附分子-1，介導(dǎo)與心肌細(xì)胞結(jié)合，損傷心肌［10］。這兩種細(xì)胞因子的水平與缺血再灌注后的損傷程度有密切關(guān)聯(lián)。本研究顯示MIRI組的血清及心肌組織中炎癥因子TNF-α和IL-6含量明顯高于假手術(shù)組，這說明 TNF-α和IL-6均參與了缺血再灌注損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組與MIRI組相比，TNF-α和IL-6含量顯著降低，說明天麻素預(yù)處理能減輕缺血再灌注損傷時(shí)炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。同時(shí)形態(tài)學(xué)表明，缺血再灌注時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，而0.2、0.4 g/kg天麻素預(yù)處理后炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，亦從形態(tài)學(xué)角度再次證明了上述觀點(diǎn)。以上結(jié)果提示天麻素預(yù)處理后能通過減少缺血再灌注時(shí)炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，從而抑制炎癥因子引起的中性粒細(xì)胞遷移浸潤(rùn)，減輕炎癥損傷的惡性循環(huán)，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。

Ca2+作為第二信使在心肌興奮收縮耦聯(lián)中起關(guān)鍵作用。肌漿網(wǎng)中的SERCA負(fù)責(zé)調(diào)控肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取，將心肌細(xì)胞胞漿中的Ca2+攝回肌漿網(wǎng)中。缺血再灌注后，由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸中毒，從而抑制SERCA的活性，降低肌漿網(wǎng)攝鈣的能力，久之細(xì)胞內(nèi)就會(huì)發(fā)生鈣超載，加重心肌損傷［11］。本研究顯示0.2、0.4 g/kg天麻素預(yù)處理后心肌組織中的SERCA含量增加，提示天麻素能夠增加缺血再灌注損傷時(shí)心肌組織中的SERCA的含量，從而增加對(duì)肌漿網(wǎng)Ca2+的攝取，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，對(duì)心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。因此天麻素抑制Ca2+超載可能與其增加SERCA含量有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明天麻素預(yù)處理能夠減輕MIRI，其機(jī)制可能與減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，增加SERCA的含量有關(guān)。

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