HCMV重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫反應(yīng)的初步鑒定

曾憲聰，汪小五，陳 偉，王林定，2

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)又稱(chēng)為人皰疹病毒5型，屬β-皰疹病毒亞科，HCMV感染極為普遍，在育齡期婦女中感染率可達(dá)95%以上［1－2］。此外，HCMV感染可通過(guò)胎盤(pán)侵襲胎兒引起先天性感染，少數(shù)造成早產(chǎn)、死產(chǎn)或生后死亡［3］。母嬰感染HCMV的快速診斷對(duì)于決定是否保留胎兒，及采取何種干預(yù)措施非常重要。目前國(guó)內(nèi)外已有多家實(shí)驗(yàn)室及試劑生產(chǎn)廠(chǎng)家研制生產(chǎn)HCMV IgM抗體檢測(cè)試劑盒，由于缺乏靈敏度強(qiáng)和特異性高的抗原以及生產(chǎn)條件和標(biāo)準(zhǔn)各異［4］，因此該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究HCMV相關(guān)基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室診斷與應(yīng)用提供支持，提高我國(guó)孕婦早期HCMV感染的檢出率。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 pQE-80L、菌株BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ購(gòu)自日本TaKaRa公司;PVDF膜購(gòu)自上海生物工程有限公司;Ni2+-NTA親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE公司;50 ml親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自上海生物工程有限公司;HRP標(biāo)記山羊抗人IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自瑞士Thermo公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 HCMV抗原片段引物設(shè)計(jì) 利用Protean軟件分析了 UL32［5－6］、UL44［7］、UL83［8－9］、氨基酸序列，抗原性強(qiáng)且親水性好的片段。分析了 UL32、UL44、UL83氨基酸序列。選擇 UL32A(372aa～442aa，213 bp)UL32B(522aa ～ 552aa，93 bp)、UL32C(705aa～727aa，69 bp);UL44選擇2個(gè)片段，分別為 UL44A(1aa ～40aa，120 bp、)UL44B(403aa～421aa，57 bp);UL83選擇 3個(gè)片段，分別為UL83A(169aa ～ 271aa，309 bp)、UL83B(361aa ～478aa，354 bp)、UL83C(535aa ～ 561aa，81 bp)。選取在蛋白質(zhì)N端和C端之間的區(qū)域，Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處;Kyte-Doolittle預(yù)測(cè)親水性強(qiáng)的區(qū)域。最后將選擇好的氨基酸序列連成一條完整序列，預(yù)測(cè)重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的可溶性。預(yù)測(cè)網(wǎng)址:http://biotech.ou.edu/。然后根據(jù)選定基因段序列，設(shè)計(jì)合理引物。各基因的片段用Overlap PCR方法連接，引入 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)，Overlap PCR引物設(shè)計(jì)，在引物A2的3'端加入了B基因5'端的序列，在引物B1的5'端加入了20個(gè)A基因3'端序列。由于需要構(gòu)建到pQE-80L的質(zhì)粒中，故在每個(gè)融合基因的兩端加入酶切位點(diǎn)，在引物B2的3'端加入BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，引物A1的5'端加入BglⅡ與SalⅠ酶切位點(diǎn)，便于引入新的基因片段。見(jiàn)表1。

1.3.2 含目的基因的克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物膠回收，按DNA回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pQE-80L載體進(jìn)行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取過(guò)夜培養(yǎng)的單菌落，接種于5 ml含Amp的LB培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，(按質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作)。質(zhì)粒經(jīng)PCR(PCR反應(yīng)體系:94℃變性3 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min;循環(huán)35次，72℃延伸10 min)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物。質(zhì)粒和酶切產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 重組質(zhì)粒引物

1.3.3 重組質(zhì)粒 pQE-80L-UL32-UL44-UL83轉(zhuǎn)化將pQE80-L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，冰浴30 min，42℃水浴中熱擊60 s，冰浴5 min。加入600 μl LB培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)45 min后，離心后將菌液均勻涂布在含Amp抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.4 目的蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)與純化 挑取轉(zhuǎn)化了含有目的片段的pQE-80L重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落，接種到3 ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后，按1∶50轉(zhuǎn)種2～4 h(OD600達(dá)0.5左右)取1 ml做誘導(dǎo)前對(duì)照，按1∶1 000加入誘導(dǎo)劑(IPTG)終濃度為1 mmol/L，次日取5 ml復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)種到500 ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。樣品加入終濃度1 mmol/L的IPTG。培養(yǎng)6、8 h各取1 ml培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)后樣品4 000 r/min離心10 min收集剩余菌體。兩次取樣用于SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)情況。

含重組菌的LB培養(yǎng)液(500 ml)7 000 r/min離心30 min用裂解緩沖液(非變性)懸浮沉淀的菌體。加入終濃度為1 mg/ml溶菌酶及終濃度為1 mmol/ml蛋白酶抑制劑PMSF，冰上放置30 min。超聲波破碎儀破碎菌體8 000 r/min離心30 min，過(guò)濾收集上清液即為上清粗蛋白(目的為防止有雜質(zhì)堵住柱頭避免柱流速度過(guò)慢)。沉淀加含8 mol/L尿素的變性裂解緩沖液50 ml室溫溶解8 000 r/min離心30 min后取上清液過(guò)濾后即為包涵體粗蛋白。分別取少量上清液和包涵體樣品電泳確定目的蛋白的表達(dá)部位。

Ni-NTA填料的預(yù)處理:用10倍柱體積的ddH2O清洗Ni2+親和層析柱，用10倍的裂解緩沖液平衡柱子后，將已預(yù)處理好的Ni-NTA懸浮液混勻填裝柱子，柱體積達(dá)到約1.5 ml。將上清液或包涵體蛋白質(zhì)樣品反復(fù)上柱2～3次。依次用5倍柱體積的裂解緩沖液(pH 8.0);5倍柱體積的洗滌緩沖液(pH 6.3)過(guò)柱，洗脫雜蛋白;用 5倍柱體積的洗脫緩沖液(pH 5.9)將吸附在Ni柱中的目的蛋白洗脫，控制流速0.5 ml/min左右分管收集洗脫樣品。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)目的蛋白免疫原性 蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，Western blot按照(分子克隆)所述方法，所用一抗(1∶100)為HCMV確診患者陽(yáng)性血清和普通人群正常血清各一份。而二抗HRP標(biāo)記山羊抗人IgG抗體(1∶15 000)加入化學(xué)發(fā)光劑，曝光，拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組融合抗原表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定 獲得的重組質(zhì)粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83，經(jīng) PCR擴(kuò)增鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出約1 356 bp大小的相應(yīng)基因片段。證明該融合抗原表達(dá)質(zhì)粒均已構(gòu)建成功，送樣至上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，序列比對(duì)正確。見(jiàn)圖1A。

2.2 重組融合抗原表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定 挑取重組質(zhì)粒 pQE80-L-UL32-UL44-UL83，用 BamHⅠ，SalⅠ做雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，電泳出現(xiàn)1 356 bp大小的條帶，證明PQE-80L表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。酶切有目的條帶的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。見(jiàn)圖1B。

2.3 HCMV重組融合抗原蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化將HCMV重組融合抗原質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)受體菌中，ITPG誘導(dǎo)后，重組蛋白成功表達(dá)

圖1 pQE80-L-UL32-UL44-UL8目的基因PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定A:HCMV重組融合抗原表達(dá)質(zhì)粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83質(zhì)粒酶切電泳圖;B:HCMV重組融合抗原表達(dá)質(zhì)粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83 PCR產(chǎn)物電泳圖;M:Marker;1:重組 pQE80-L-UL32-UL44-UL83質(zhì)粒雙酶切;2:PCR產(chǎn)物

于大腸桿菌中，并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)情況，電泳顯示重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涵體粗蛋白經(jīng)過(guò)Ni親和層析純化，見(jiàn)圖2，含pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)表達(dá)含大小約為52 ku的蛋白，SDS-PAGE電泳6～7泳道顯示約在50 ku處有條帶，與預(yù)期目的蛋白大小相一致;但在約70 ku的位置也出現(xiàn)了一條帶，考慮其為蛋白特異性條帶。

圖2 HCMV重組嵌合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化M:Marker;1:重組菌誘導(dǎo)前;2～3:重組菌誘導(dǎo)后6、8 h;4:重組菌破碎后上清液;5:重組菌破碎后包涵體;6～7:重組菌體Ni2+-NTA柱純化

2.4 Western blot法鑒定免疫反應(yīng)性 純化了的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳之后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western blot鑒定，誘導(dǎo)前后與純化后的結(jié)果。見(jiàn)圖3。通過(guò)ELISA篩查出陽(yáng)性和陰性血清各一份作為一抗;誘導(dǎo)的菌體蛋白中沒(méi)有和HCMV陽(yáng)性血清反應(yīng)的條帶，但是有一些非特異性的條帶，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后和目的蛋白純化后的樣品在預(yù)期分子量處出現(xiàn)了特異性的條帶，這和上圖誘導(dǎo)純化后條帶相符，而且反應(yīng)性很強(qiáng)。初步證實(shí)此重組融合抗原是HCMV的特異性抗原;具有免疫反應(yīng)性。

圖3 Western blot法分析重組融合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83A:HCMV陽(yáng)性血清反應(yīng);B:HCMV陰性血清反應(yīng);M:Marker;1:誘導(dǎo)前樣品;2:誘導(dǎo)后樣品;3:Ni2+-NTA純化后蛋白樣品Western blot HCMV+是與陽(yáng)性血清作為一抗有反應(yīng)，HCMV－是與陰性血清作為一抗均沒(méi)有反應(yīng)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分析了 HCMV UL32、UL44、UL83蛋白抗原性強(qiáng)且親水性高的氨基酸片段，分別編碼抗原p150、p52、pp65 具有很好的抗原性;有文獻(xiàn)［10－11］報(bào)道多種巨細(xì)胞病毒抗原組合可以獲得比單一重組抗原更好的結(jié)果，國(guó)內(nèi)方毅 等［11］報(bào)道用重組嵌合抗原gp52和PP150的抗原性做了檢測(cè)分析，陽(yáng)性率也達(dá)到了 92%。國(guó)內(nèi)孫鵬 等［12］報(bào)道了 p150、p52、pp65的靈敏度/特異性分別是70%/100%、80%/100%、73.3%/100%，Landini et al［13］對(duì) UL44、UL80a單一片段的重組抗原和多功能重組抗原做了比較，證明多種巨細(xì)胞抗原重組陽(yáng)性檢出率(98%)明顯高于單片段重組抗原陽(yáng)檢率(72%)。從結(jié)果可知重組單片段優(yōu)勢(shì)抗原可以克服全病毒假陽(yáng)性反應(yīng)，但是陽(yáng)性檢出率較低;用重組巨細(xì)胞病毒融合抗原可獲得比單一片段重組抗原更好的結(jié)果。綜上文獻(xiàn)報(bào)道都充分證實(shí)了選用多個(gè)基因片段構(gòu)建的重組嵌合抗原檢測(cè)HCMV可以大大提高感染檢出率，檢測(cè)早期活動(dòng)性的感染，其實(shí)際價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單片段的檢測(cè)［13］。因此筆者通過(guò)將HCMV各基因相應(yīng)氨基酸序列相融合，通過(guò)與pQE80-L質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，再通過(guò)不斷酶切連接的方法，成功構(gòu)建HCMV重組融合抗原表達(dá)質(zhì)粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83;其酶切后大小如圖1所示為1 356 bp，且序列測(cè)序比對(duì)正確。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)后，可成功表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分離及Western blot驗(yàn)證，確證其為目的蛋白。重組菌在經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG成功誘導(dǎo)6～8 h后，收集并破碎菌體，經(jīng)確認(rèn)其表達(dá)是在包涵體中。通過(guò)Ni2+-NTA進(jìn)行初步純化，含His-Tag的蛋白可被洗脫。但由于重組融合抗原蛋白較大，容易出現(xiàn)比目的蛋白較大的條帶;如圖2結(jié)果顯示在分子量(Marker)50 ku處有目的條帶出現(xiàn)，但是約在70 ku顯示有一條條帶，在圖3的Western blot鑒定中得到證實(shí)考慮為重組融合抗原的特異性條帶;與血清結(jié)合反應(yīng)也證實(shí)了該重組嵌合抗原其具有很好免疫反應(yīng)性和特異性。

由于HCMV目前診斷沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)及其標(biāo)準(zhǔn)的診斷試劑盒。有報(bào)道［14］表明間接ELISA的抗HCMV-IgM陰性并不能排除HCMV感染的可能性。設(shè)計(jì)這種重組質(zhì)粒，可以在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行比較重組蛋白的特異性及靈敏度。提高孕婦HCMV早期感染檢出率;提高優(yōu)生優(yōu)育，及其他相關(guān)疾病的發(fā)生;開(kāi)發(fā)HCMV早期診斷的快速、靈敏的診斷試劑盒，就顯得更有意義。

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