新型益腦雙聯(lián)體防治阿爾采末病作用及機(jī)制研究進(jìn)展

蘇 瑋，朱龍軍，許大平，崔 巍，3，張?jiān)谲姡?，胡勝全，3，麥成雄，3，韓怡凡，3

（1.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)技術(shù)學(xué)系，香港；2.暨南大學(xué)新藥研究所，廣東廣州 510632；3.香港理工大學(xué)深圳研究院，廣東深圳 518057）

阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）是由腦病變損害導(dǎo)致患者記憶、思維和行為障礙的慢性神經(jīng)退行性疾病。大多數(shù)AD患者的年齡超過(guò)65歲。據(jù)統(tǒng)計(jì)AD患病率約占老年人10%，85歲以上人群的發(fā)病率更接近50%。隨著人口的持續(xù)老齡化，AD已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大殺手?，F(xiàn)今全世界AD患病人數(shù)超過(guò)2 500萬(wàn)，我國(guó)估計(jì)已達(dá)700萬(wàn)［1］。美國(guó)每年用于AD患者的護(hù)理和藥費(fèi)支出高達(dá)1100億美元，超過(guò)了心腦血管疾病和惡性腫瘤 。因此，AD已成當(dāng)代社會(huì)和家庭的沉重負(fù)擔(dān)，它不僅是一個(gè)重大的醫(yī)學(xué)問(wèn)題，更是一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。

AD典型病理特征是老年斑（senile plaques）、神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles）以及與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行性凋亡。雖然AD發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚不明了，但學(xué)界普遍認(rèn)可AD是多因素、多環(huán)節(jié)機(jī)制介導(dǎo)的復(fù)雜疾病，并提出膽堿能學(xué)說(shuō)、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）毒性學(xué)說(shuō)、神經(jīng)興奮性毒性學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、自由基損傷學(xué)說(shuō)等多種學(xué)說(shuō)，從不同角度闡述AD的分子機(jī)制和病理變化。這些學(xué)說(shuō)對(duì)深入理解AD發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效防治藥物有重要指導(dǎo)意義［2］。

Aβ毒性學(xué)說(shuō)在眾多學(xué)說(shuō)中尤其受到關(guān)注。AD相關(guān)遺傳、環(huán)境因素可誘導(dǎo)β-淀粉樣前體蛋白（APP）過(guò)度表達(dá)，提高β-和γ-分泌酶活性，降低α-分泌酶的活性，促進(jìn)Aβ分泌。Aβ存在單體、寡聚體、纖維等不同聚集形式。其中，可溶性Aβ寡聚體具有極高神經(jīng)毒性，可抑制長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）形成、并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。AD患者腦中可溶性Aβ寡聚體濃度與認(rèn)知能力降低呈因果相關(guān)［3］。這些證據(jù)提示可溶性Aβ寡聚體是AD的主要致病分子，立足于對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性的“對(duì)因治療”方案是突破AD治療瓶頸的關(guān)鍵。

臨床治療AD嚴(yán)重依賴“一藥一靶位”（one-drug-singletarget）的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）抑制劑和 N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 （N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體拮抗劑。但“一藥一靶位”藥物治療AD在本質(zhì)上存在不足。AD發(fā)病與多基因、多環(huán)節(jié)相關(guān)，“一藥一靶位”藥物僅能緩解AD病癥，無(wú)法產(chǎn)生“對(duì)因治療”效果。此外，許多AD靶標(biāo)具有生理功能，過(guò)分抑制容易導(dǎo)致副作用。臨床數(shù)據(jù)也顯示，“一藥一靶位”藥物療效非常有限，僅能改善部分AD患者癥狀。

“一藥多靶位”（one-drug-multiple-target）藥物可能是防治AD最有前途的方向。首先，Aβ、AChE、NMDA受體、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）等已被證實(shí)是防治AD的重要靶標(biāo)。其次，部分AChE抑制劑也被發(fā)現(xiàn)能同時(shí)作用多個(gè)靶位。此外，“一藥多靶位”藥物在臨床治療學(xué)上也有明顯優(yōu)勢(shì)，能克服聯(lián)合用藥的缺陷，提高AD患者的順應(yīng)性。

近10余年，本研究小組致力“一藥多靶位”防治AD藥物的研究，并成功研制了一系列包含他克林（tacrine，Cognex?）和石杉?jí)A甲（huperzine A）片段的新型高活性抗AD雙聯(lián)體（Fig 1）［4］。這些雙聯(lián)體合成步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，且已在眾多AD細(xì)胞、動(dòng)物模型展示了優(yōu)于臨床AD藥物的療效，精巧地體現(xiàn)了中西藥物的最優(yōu)化組合，展示了傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中的嶄新趨勢(shì)。本文綜述其中具代表性的新型益腦雙聯(lián)體（Bis（n）-Cognitin，又稱 Bis（n）-tacrine）防治 AD的藥理作用及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 Bis（n）-Cognitin同時(shí)結(jié)合AChE兩個(gè)活性中心、選擇性抑制AChE

Sussman等［5］應(yīng)用X射線-單晶衍射技術(shù)解析了AChE的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AChE具有催化陰離子位點(diǎn)（catalytic anionic site）和外周陰離子位點(diǎn)（peripheral anionic site，）兩個(gè)活性中心，分別發(fā)揮催化乙酰膽堿（acetylcholine）水解和調(diào)節(jié)酶活性的作用。他克林是臨床用于AD治療的AChE抑制劑。Pang等［6］應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)他克林能結(jié)合AChE的兩個(gè)活性中心，因此提出通過(guò)橋聯(lián)基團(tuán)將雙分子他克林鏈接，以期獲得能同時(shí)結(jié)合AChE兩個(gè)活性中心、具有更高抑制活性的Bis（n）-Cognitin（Fig 2）。另一方面，由于丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BuChE）不具備外周陰離子位點(diǎn)，因此，Bis（n）-Cognitin有望選擇性抑制AChE。

Fig 2 Structure-based rational drug design for Bis（n）-Cognitin（adapted from Pang et al.［6］）

Pang等［6］合成了不同鏈長(zhǎng)的 Bis（n）-Cognitin，并測(cè)試其體外AChE抑制活性和選擇性，結(jié)果顯示：Bis（n）-Cognitin可明顯抑制AChE，其中Bis（7）-Cognitin（7個(gè)亞甲基連接的雙聯(lián)體）的活性最高，其半抑制濃度（IC50）達(dá)到1.6 nmol·L-1。與他克林相比，Bis（7）-Cognitin的AChE抑制活性強(qiáng)了1 000倍，選擇性強(qiáng)了10 000倍。酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin對(duì)AChE抑制模式為混合型，表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Ki）為 1.4～2.8 nmol·L-1，證實(shí)了 Bis（n）-Cognitin通過(guò)同時(shí)結(jié)合催化位點(diǎn)和外周位點(diǎn)抑制AChE。Yu等［7］測(cè)試了Bis（n）-Cognitin在體AChE抑制活性，結(jié)果顯示：口服或腹腔注射Bis（7）-Cognitin均能明顯抑制大鼠腦內(nèi)AChE，且抑制活性和選擇性均高于他克林。這些研究結(jié)果證實(shí)Bis（n）-Cognitin能同時(shí)結(jié)合 AChE兩個(gè)活性中心，選擇性抑制AChE。

2 Bis（n）-Cognitin多靶點(diǎn)抑制Aβ神經(jīng)毒性

Aβ構(gòu)成的老年斑是AD的主要病理特征，可溶性Aβ寡聚體是AD的主要致病分子。對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性是“對(duì)因治療”AD的主要目標(biāo)。Fu等［8］應(yīng)用轉(zhuǎn)染APP的N2a細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可阻止細(xì)胞分泌Aβ，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin是通過(guò)激活蛋白激酶 C（protein kinase C）、增強(qiáng)α-分泌酶活性實(shí)現(xiàn)上述作用的。Fu等［8］還發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可直接抑制重組人源β-分泌酶，其半抑制濃度為7.5μmol·L-1，提示 Bis（7）-Cognitin可能通過(guò)同時(shí)抑制β-分泌酶、提高α-分泌酶活性，阻止 Aβ分泌。此外，F(xiàn)u等［9］發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可預(yù)防 Aβ25-35纖維、Aβ1-42纖維以及可溶性Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究表明：Bis（7）-Cognitin是通過(guò)拮抗L-型鈣離子通道對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性的。另外，本研究小組初步研究還發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin能提高高頻電刺激誘發(fā)的LTP、逆轉(zhuǎn)可溶性Aβ寡聚體誘導(dǎo)的LTP抑制。這些研究證實(shí)Bis（n）-Cognitin能多靶點(diǎn)抑制Aβ神經(jīng)毒性，提示Bis（n）-Cognitin可能“對(duì)因治療”AD。

3 Bis（n）-Cognitin通過(guò)同時(shí)抑制NMDA受體及nNOS阻斷神經(jīng)興奮性毒性

谷氨酸（glutamate）誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性是AD中神經(jīng)細(xì)胞死亡的“最后通路”。阻斷神經(jīng)興奮性毒性是治療AD的重要手段。Li等［10］發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可在大鼠小腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性。Luo等［11］應(yīng)用同一模型發(fā)現(xiàn)，Bis（3）-Cognitin也有類似的神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步電生理學(xué)研究顯示：Bis（7）-Cognitin和Bis（3）-Cognitin可抑制NMDA誘發(fā)電流，其半抑制濃度分別為0.19和0.52μmol·L-1，效價(jià)分別是美金剛的9倍和3倍，證實(shí)Bis（n）-Cognitin是NMDA受體拮抗劑，可通過(guò)拮抗NMDA受體對(duì)抗神經(jīng)興奮性毒性。此外，Luo等［11］發(fā)現(xiàn)Bis（n）-Cognitin拮抗NMDA受體具有電壓依賴、反競(jìng)爭(zhēng)、快速解離等特性，可特異抑制病理?xiàng)l件下激活的NMDA受體，而對(duì)NMDA正常功能幾無(wú)影響，提示Bis（n）-Cognitin臨床副作用可能較小。

nNOS是神經(jīng)興奮性毒性的重要中介分子，NMDA受體興奮后活化nNOS，產(chǎn)生一氧化氮（NO），促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Li等［12］應(yīng)用谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性模型，發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin能降低細(xì)胞內(nèi)NO水平。體外放射性酶活實(shí)驗(yàn)顯示：Bis（7）-Cognitin可競(jìng)爭(zhēng)性抑制重組人源 nNOS，其半抑制濃度為2.9μmol·L-1，提示 Bis（7）-Cognitin可能通過(guò)同時(shí)抑制NMDA受體、nNOS，對(duì)抗神經(jīng)興奮性毒性。這些研究證實(shí)，Bis（n）-Cognitin是“一藥多靶位”化合物，可能多靶點(diǎn)阻止神經(jīng)興奮性毒性。

Fig 1 Chem ical structures of Bis（n）-Cognitin，Tacrine（n）-hupyridone and Bis（n）-hupyridone

4 Bis（n）-Cognitin對(duì)抗氧化應(yīng)激和線粒體損傷

氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在AD發(fā)生、發(fā)展中有重要影響。Xiao等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin對(duì) H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有明顯保護(hù)作用。H2O2可明顯降低細(xì)胞存活率、減少谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase）和過(guò)氧化氫酶（catalase）活性、增加細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde）積累，而B(niǎo)is（7）-Cognitin預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)上述變化。此外，F(xiàn)u等［14］通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin可增加抗增殖蛋白（prohibitin）、電壓敏感性陰離子通道蛋白 1（voltage-dependent anion channel 1 protein）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90）、14-3-3β蛋白在線粒體的表達(dá)，挽救谷氨酸誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降，證明Bis（n）-Cognitin有抗線粒體損傷作用，可能用于AD治療。

5 Bis（n）-Cognitin調(diào)控信號(hào)通路預(yù)防細(xì)胞凋亡

AD神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，涉及磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3-K）/蛋白激酶 B（Akt）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）、p38等眾多信號(hào)通路［15］。Hu等［16］發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin在大鼠小腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞可預(yù)防撤鉀誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Bis（3）-Cognitin激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）及下游 PI3-K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。Yao等［17］發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin激活PI3-K/Akt信號(hào)通路后可提高下游肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2D（myocyte enhancer factor-2D，MEF2D）的轉(zhuǎn)錄活性，預(yù)防1-甲基-4-苯基吡啶（MPP＋）以及 α-突觸核蛋白（α-synuclein）誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，Li等［10］發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可通過(guò)同時(shí)抑制 ERK、p38信號(hào)通路，預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Hu等［18］發(fā)現(xiàn)Bis（3）-Cognitin可通過(guò)激活 PI3-K/Akt、抑制 ERK信號(hào)通路，對(duì)抗神經(jīng)興奮性毒性。這些研究證實(shí)Bis（n）-Cognitin可通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路，阻止細(xì)胞凋亡，提示Bis（n）-Cognitin可能預(yù)防AD等神經(jīng)退行性疾病。

6 Bis（n）-Cognitin拮抗離子通道型受體緩解AD癥狀

AD病程中，患者腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)發(fā)生改變。因此，可望通過(guò)綜合調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)緩解AD癥狀，改善患者情緒、認(rèn)知。Li等［19］發(fā)現(xiàn) Bis（n）-Cognitin可抑制 γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）誘發(fā)電流。其中，Bis（2）-Cognitin的半抑制濃度為0.48μmol·L-1，效價(jià)是荷包牡丹堿的11倍，證明 Bis（n）-Cognitin是極強(qiáng)的 γ-氨基丁酸 A受體（GABAAreceptor）拮抗劑。Ros等［20］等發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可抑制乙酰膽堿誘發(fā)電流，其半抑制濃度為0.16μmol·L-1，顯示 Bis（n）-Cognitin對(duì)煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor）也有拮抗作用。此外，Luo等［21］發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin還可抑制 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine）誘發(fā)電流，其半抑制濃度為 2.0μmol·L-1，表明 Bis（n）-Cognitin是5-羥色胺3型離子通道受體（5-HT3receptor）拮抗劑。以上研究證實(shí)，Bis（n）-Cognitin是優(yōu)秀的“一藥多靶標(biāo)”化合物，能夠拮抗多種離子通道型受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，可望在“對(duì)因治療”AD的同時(shí)緩解AD癥狀。

7 Bis（n）-Cognitin明顯改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力

AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性衰退，治療AD的首要任務(wù)是恢復(fù)患者學(xué)習(xí)記憶能力。Wang等［22］通過(guò)東茛菪堿致大鼠癡呆模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射Bis（7）-Cognitin能明顯縮短動(dòng)物在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的尋臺(tái)潛伏期，其效價(jià)是他克林的12倍。Pan等［23］應(yīng)用同一模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射 Bis（7）-Cognitin能減少動(dòng)物避暗實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)，其效價(jià)是他克林的5倍。Han等［24］發(fā)現(xiàn)腹腔注射 Bis（3）-Cognitin和 Bis（7）-Cognitin均可明顯提高腹腔注射東茛菪堿小鼠的新物體認(rèn)知能力和空間記憶能力，其效價(jià)分別是他克林的5倍和20倍。另外，Liu等［25］通過(guò)腦室注射膽堿能神經(jīng)毒素AF64A的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射Bis（7）-Cognitin對(duì)動(dòng)物空間認(rèn)知能力下降有明顯改善作用。這些結(jié)果均證實(shí)Bis（n）-Cognitin能明顯改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力損傷，可用于AD治療。

8 Bis（n）-Cognitin在多種動(dòng)物模型阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡

在體阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡是治療神經(jīng)退行性疾病的主要途徑［26］。Zhao等［27］研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin和 Bis（3）-Cognitin可明顯降低大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注誘導(dǎo)的梗死灶面積。Shu等［28］在老齡大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin能改善缺血引起的動(dòng)物認(rèn)知能力損傷，其機(jī)制與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少有關(guān)。Li等［29］通過(guò)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注模型研究發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可對(duì)抗缺血引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。最近，Yao等［17］還發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin能保護(hù)小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)抗 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）引起的動(dòng)物行為能力損傷。以上研究結(jié)果均顯示Bis（n）-Cognitin具有極強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)活性，不僅可能“對(duì)因治療”AD，還能有助于血管性癡呆、帕金森病、青光眼等神經(jīng)退行性疾病的治療。

9 小結(jié)與展望

綜上所述，Bis（n）-Cognitin可同時(shí)作用 AChE、β-分泌酶、NMDA受體、nNOS等多個(gè)AD重要靶標(biāo)，抑制Aβ神經(jīng)毒性、阻斷神經(jīng)興奮性毒性、降低氧化應(yīng)激和線粒體損傷。此外，Bis（n）-Cognitin還能阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善動(dòng)物認(rèn)知障礙。作為優(yōu)秀的“一藥多靶位”化合物，Bis（n）-Cognitin極有可能成為未來(lái)防治AD，甚至其他神經(jīng)退行性疾病的高效藥物。

但要將Bis（n）-Cognitin開(kāi)發(fā)成藥，研究還需考慮多方面問(wèn)題。如AD動(dòng)物模型不能完全模擬人類AD發(fā)病全部特征，因此需要驗(yàn)證Bis（n）-Cognitin在多個(gè)AD動(dòng)物模型，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的療效。另外，Bis（n）-Cognitin的安全性及臨床療效也需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Chan K Y，WangW，Wu JJ，etal.Epidemiology of Alzheimer′s disease and other forms of dementia in China，1990-2010：a systematic review and analysis［J］.Lancet，2013，381（9882）：2016-23.

［2］ 駱 靜，吳 鐳.NSFC資助下的阿爾采末病藥物作用靶點(diǎn)的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（15）：1423-8.

［2］ Luo J，Wu L.Advances in the research on targets for drug discovery for Alzheimer′s disease supported by NSFC［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21（15）：1423-8.

［3］ 劉 明，辛現(xiàn)良，周瑞宇，等.Aβ寡聚體與阿爾采末病及其靶點(diǎn)藥物研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（12）：1554-7.

［3］ Liu M，Xin X L，Zhou R Y，et al.Progress in soluble Aβoligomers in Alzheimer′s disease and drugs targeting Aβoligomers［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24（12）：1554-7.

［4］ Koch H，Rosch W，F(xiàn)ruhmorgen P，et al.Diagnosis of acute gastrointestinal hemorrhages［J］.MMW Munch Med Wochenschr，1979，121（29-30）：975-6.

［5］ Sussman JL，Harel M，F(xiàn)rolow F，et al.Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica：a prototypic acetylcholine-binding protein［J］.Science，1991，253（5022）：872-9.

［6］ Pang Y P，Quiram P，Jelacic T，et al.Highly potent，selective，and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of acetylcholinesterase.Steps toward novel drugs for treating Alzheimer′s disease［J］.JBiol Chem，1996，271（39）：23646-9.

［7］ Yu H，LiW M，Kan K K，et al.The physicochemical properties and the in vivo AChE inhibition of two potential anti-Alzheimer agents，bis（12）-hupyridone and bis（7）-tacrine［J］.J Pharm Biomed Anal，2008，46（1）：75-81.

［8］ Fu H，Dou J，LiW，et al.Promisingmultifunctional anti-Alzheimer′s dimer bis（7）-Cognitin acting as an activator of protein kinase C regulates activities of alpha-secretase and BACE-1 concurrently［J］.Eur JPharmacol，2009，623（1-3）：14-21.

［9］ Fu H，LiW，Lao Y，et al.Bis（7）-tacrine attenuates beta amyloid-induced neuronal apoptosis by regulating L-type calcium channels［J］.JNeurochem，2006，98（5）：1400-10.

［10］LiW，Pi R，Chan H H，et al.Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine，but not donepezil，prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors［J］.JBiol Chem，2005，280（18）：18179-88.

［11］Luo J，LiW，Zhao Y，etal.Pathologically activated neuroprotection via uncompetitive blockade of N-methyl-D-aspartate receptors with fast off-rate by novelmultifunctional dimer bis（propyl）-cognitin［J］.JBiol Chem，2010，285（26）：19947-58.

［12］Li W，Xue J，Niu C，et al.Synergistic neuroprotection by bis（7）-tacrine via concurrent blockade of N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal nitric-oxide synthase［J］.Mol Pharmacol，2007，71（5）：1258-67.

［13］Xiao X Q，Lee N T，Carlier PR，et al.Bis（7）-tacrine，a promising anti-Alzheimer′s agent，reduces hydrogen peroxide-induced injury in rat pheochromocytoma cells：comparison with tacrine［J］.Neurosci Lett，2000，290（3）：197-200.

［14］Fu H，LiW，Liu Y，et al.Mitochondrial proteomic analysis and characterization of the intracellular mechanisms of bis（7）-tacrine in protecting against glutamate-induced excitotoxicity in primary cultured neurons［J］.JProteome Res，2007，6（7）：2435-46.

［15］李 寧，劉耕陶.糖原合成激酶3：一個(gè)治療阿爾采末病潛在的藥物新靶點(diǎn)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（12）：1544-8.

［15］LiN，Liu G T.Glycogen synthase kinase-3：an emerging therapeutic target for Alzheimers disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（12）：1544-8.

［16］Hu SQ，CuiW，Xu D P，et al.Substantial neuroprotection against K（＋）deprivation-induced apoptosis in primary cerebellar granule neurons by novel dimer bis（propyl）-cognitin via the activation of VEGFR-2 signaling pathway［J］.CNS Neurosci Ther，2013，19（10）：764-72.

［17］Yao L，Li W，She H，et al.Activation of transcription factor MEF2D by bis（3）-cognitin protects dopaminergic neurons and ameliorates Parkinsonian motor defects［J］.J Biol Chem，2012，287（41）：34246-55.

［18］Hu S，Cui W，Mak S，et al.Bis（propyl）-cognitin protects againstglutamate-induced neuro-excitotoxicity via concurrent regulation of NO，MAPK/ERK and PI3-K/Akt/GSK3beta pathways［J］.Neurochem Int，2013，62（4）：468-77.

［19］Li C，Carlier PR，Ren H，et al.Alkylene tether-length dependent gamma-aminobutyric acid type A receptor competitive antagonism by tacrine dimers［J］.Neuropharmacology，2007，52（2）：436-43.

［20］Ros E，Aleu J，Gomez de Aranda I，et al.Effects of bis（7）-tacrine on spontaneous synaptic activity and on the nicotinic ACh receptor of Torpedo electric organ［J］.J Neurophysiol，2001，86（1）：183-9.

［21］Luo JL，Zhang J，Guan B C，et al.Inhibition by bis（7）-tacrine of 5-HT-activated current in rat TG neurons［J］.Neuroreport，2004，15（8）：1335-8.

［22］Wang H，Carlier P R，Ho W L，et al.Attenuation of scopolamine-induced deficits in navigationalmemory performance in rats by bis（7）-tacrine，a novel dimeric AChE inhibitor［J］.Zhongguo Yao Li Xue Bao，1999，20（3）：211-7.

［23］Pan SY，Yu Z L，Xiang C J，etal.Comparison studies of tacrine and bis7-tacrine on the suppression of scopolamine-induced behavioral changes and inhibition of acetylcholinesterase inmice［J］.Pharmacology，2009，83（5）：294-300.

［24］Han RW，Zhang R S，Chang M，et al.Reversal of scopolamineinduced spatial and recognition memory deficits in mice by novel multifunctional dimers bis-cognitins［J］.Brain Res，2012，1470：59-68.

［25］Liu J，HoW，Lee N T，et al.Bis（7）-tacrine，a novel acetylcholinesterase inhibitor，reverses AF64A-induced deficits in navigationalmemory in rats［J］.Neurosci Lett，2000，282（3）：165-8.

［26］雷 慧，王曉良，彭 英.線粒體損傷與阿爾采末?。跩］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：1337-41.

［26］Lei H，Wang X L，Peng Y.Mitochondrialdysfunction and Alzheimer′s disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（10）：1337-41.

［27］Zhao Y，LiW，Chow PC，etal.Bis（7）-tacrine，a promising anti-Alzheimer′s dimer，affords dose-and time-dependent neuroprotection against transient focal cerebral ischemia［J］.Neurosci Lett，2008，439（2）：160-4.

［28］Shu X J，Liu W，Zhang L，etal.Effectof bis（7）-tacrine on cognition in rats with chronic cerebral ischemia［J］.Neurosci Lett，2012，512（2）：103-8.

［29］Li JB，Lu ZG，Xu L，et al.Neuroprotective effects of Bis（7）-tacrine in a rat model of pressure-induced retinal ischemia［J］.Cell Biochem Biophys，2014，68（2）：275-82.