清熱養(yǎng)心顆粒中綠原酸在不同血漿中的蛋白結(jié)合率測定

吳 磊，陸 超，戴國梁，孫冰婷，丁 康，居文政

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京 210029）

清熱養(yǎng)心顆粒是江蘇省中醫(yī)院制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱解毒之功，臨床主要用于病毒性心肌炎等的治療。現(xiàn)代研究表明，該制劑中綠原酸有明顯的抗炎、抗氧化、抗凝血等多種活性［1］，且是指標(biāo)性成分［2］。

藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)的重要參數(shù)之一，影響藥物在體內(nèi)的分布、排泄和代謝速率，對藥物的半衰期也有影響，與藥物的藥理藥效作用密切相關(guān)。因此，它是新藥臨床評價中不可缺少的指標(biāo)。研究表明［3］藥物間可能存在競爭性蛋白結(jié)合，而綠原酸在清熱養(yǎng)心顆粒中的血漿蛋白結(jié)合率尚未見報道。本文選取綠原酸為檢測指標(biāo)，采用平衡透析法研究其在大鼠、人、比格犬血漿中的藥物蛋白結(jié)合率，為臨床合理用藥提供血漿蛋白結(jié)合率參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清熱養(yǎng)心顆粒（江蘇省中醫(yī)院醫(yī)院制劑，規(guī)格：10 g/袋，批號201307001，綠原酸含量：0.47%）。對照品綠原酸（批號 110753-200413）和咖啡酸（批號 110885-200102）均購于中國藥品生物制品檢定研究院。

正常人空白血漿（江蘇省中醫(yī)院提供），大鼠、比格犬空白血漿（南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供）。大鼠許可證號：SCXK（滬）-2008-0016，比格犬許可證號：SCXK（滬）-2007-0004。

1.2 儀器 Agilent1100（包括四元泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器），Micro-17R冷凍離心機(jī)；Labconco離心濃縮儀；Direct-Q5超純水機(jī)；透析袋（14000 D，美國聯(lián)合碳化）。

1.3 綠原酸血漿蛋白結(jié)合率試驗［4］將透析袋一端折疊用線結(jié)扎，將空白血漿1 ml加入透析袋，透析袋內(nèi)留一小空氣泡，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有30 m l透析外液的帶蓋玻璃瓶中，透析外液中清熱養(yǎng)心顆粒質(zhì)量濃度分別為2、6、18 mg·L-1，調(diào)整透析袋的高度，使其內(nèi)外液面保持同一水平，并避免透析袋貼壁，將該樣品4℃放置至藥物擴(kuò)散平衡。透析結(jié)束后，用10%高氯酸溶液檢查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者該樣品作廢。

1.4 液相色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫：40℃，流速：1 ml·min-1，檢測波長：327 nm，進(jìn)樣量：20μl，流動相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸（D）＝10∶5∶85。

1.5 溶液的配制

1.5.1 空白透析液 精密稱取磷酸氫二鉀14.11 g、磷酸二氫鉀2.59 g、氯化鈉1.99 g于1 L量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，得pH 7.4磷酸緩沖液。

1.5.2 綠原酸系列溶液 精密稱定綠原酸對照品10.50 mg，加甲醇定溶至10 ml的容量瓶中，超聲20 min，得濃度1 050 mg·L-1對照品儲備液。取500μl貯備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為 525.0、262.5、131.25、65.63、32.81、16.41、8.20 mg·L-1的對照系列溶液。

1.6 樣品預(yù)處理 精密吸取血漿樣品透析內(nèi)液樣品100 μl，加50μl 1 mol·L-1鹽酸，加內(nèi)標(biāo)原兒茶醛（52.5 mg·L-1）10μl，再加 800μl乙酸乙酯，震蕩3 min，離心，取上清液吹干，100μl 50%甲醇復(fù)溶，震蕩，離心，取上清液750μl作為供試品。

1.7 方法學(xué)考察 按生物樣品分析的相關(guān)要求，考察專屬性、線性范圍、定量限、提取回收率、方法回收率、精密度。

1.8 透析膜吸附性和透析平衡時間考察 參照文獻(xiàn)［5］方法，考察透析膜對綠原酸的物理吸附作用及綠原酸的透析平衡時間。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察 在上述條件下進(jìn)行檢測，綠原酸和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為7.0 min和5.6 min左右，峰形對稱，達(dá)基線分離，空白血漿中無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，專屬性好。在透析外液及透析內(nèi)液（不同血漿）中，綠原酸在0.82～52.5 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，定量限為0.82 mg·L-1。配制綠原酸質(zhì)量濃度為2、6、18 mg·L-1的血漿質(zhì)控樣品，按“樣品預(yù)處理”項下方法操作，進(jìn)行提取回收率、方法回收率、精密度試驗；用空白透析液配制綠原酸質(zhì)量濃度為2、6、18 mg·L-1的透析外液質(zhì)控樣品，直接進(jìn)樣分析，進(jìn)行精密度試驗。結(jié)果表明，不同血漿的透析內(nèi)液中綠原酸日內(nèi)精密度RSD均小于6%，日間精密度RSD均小于8%；透析外液中綠原酸的日內(nèi)精密度RSD均小于5%，日間精密度RSD均小于7%，回收率結(jié)果見Tab 1，以上結(jié)果均符合生物樣品的檢測要求。

Tab 1 Extraction recovery and method recovery of chlorogenic acid in differentmedium（±s，n＝5）

Tab 1 Extraction recovery and method recovery of chlorogenic acid in differentmedium（±s，n＝5）

Analyte 66-1 Rats 84.3±5.5 85.6±5.2 83.6±3.2 95.8±1.6 97.Extraction recovery/%2 mg·L-1mg·L-1 18 mg·L-1 Method recovery/%2 mg·L-1mg·L-1 18 mg·L 6±2.1 96.6±1.9 Beagle dogs 86.1±4.2 89.1±3.2 90±5.1 96.6±1.4 98.1±2.3 97.8±1.1 Humans 88.5±7.2 91.0±6.1 92.4±6.3 103.3±4.599.9±3.8 102.6±2.8

2.2 透析膜吸附性和透析平衡時間 綠原酸的透析平衡時間為24 h，透析平衡后2、6、18 mg·L?的綠原酸透析膜吸附率（透析膜吸附的藥物量占總藥物量的百分比）（n＝3）分別為（2.35±1.12）%、（3.61±1.05）%、（3.51±1.42）%，表明存在微量吸附作用，對測定結(jié)果無明顯影響。

2.3 血漿蛋白結(jié)合率的測定［6］清熱養(yǎng)心顆粒中綠原酸的蛋白結(jié)合率結(jié)果見Tab 2，運(yùn)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，分別比較大鼠、比格犬和人在不同濃度藥液中的血漿蛋白結(jié)合率，且結(jié)果表明血漿蛋白結(jié)合率人＞大鼠＞比格犬。

Tab 2 Protein binding rates of three species of plasma with chlorogenic acid（±s，n＝5）

Tab 2 Protein binding rates of three species of plasma with chlorogenic acid（±s，n＝5）

Analyte Protein binding rates/%2 mg·L-1 6 mg·L-1 8 mg·L-1 Rats 45.4±2.7 47.7±3.0 45.8±1 Beagle dogs 40.3±2.1 42.6±1.8 42.9±2.3 Humans 54.3±2.0 50.2±2.5 52.1±3.1

3 討論

任靜等［7］研究綠原酸單體在不同血漿中蛋白結(jié)合率的結(jié)果表明，綠原酸在大鼠、比格犬、人的血漿蛋白結(jié)合率分別為44.2%、33.2%、43.5%，該結(jié)果與本實驗中的蛋白結(jié)合率無明顯差異，說明清熱養(yǎng)心顆粒中的其他成分對綠原酸的蛋白結(jié)合率不存在影響。

血漿中與藥物相結(jié)合的血漿蛋白主要是白蛋白、α-酸性糖蛋白和脂蛋白，其中白蛋白含量最高（正常值達(dá)35～55 g·L-1），且白蛋白主要與有機(jī)酸類藥物結(jié)合，綠原酸屬于酚酸類化合物，因此推測綠原酸在大鼠、比格犬和人血漿可能與白蛋白結(jié)合較緊密。

實驗結(jié)果看出，綠原酸在3種血漿中的蛋白結(jié)合率不同，不具有濃度依賴性，而且存在中等強(qiáng)度的蛋白結(jié)合率，在大鼠、比格犬和人血漿中的平均血漿蛋白結(jié)合率分別表現(xiàn)為人＞大鼠＞比格犬，說明綠原酸的蛋白結(jié)合率存在種屬差異性。

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