趨化因子受體CCR2拮抗劑在大鼠骨癌痛治療中的可能機(jī)制

徐振華，楊建平，胡計(jì)嬅，陳 婷左建玲

趨化因子受體CCR2是一種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，能夠與趨化因子CCL2高選擇性、高親和性的結(jié)合［1］。過去發(fā)現(xiàn)CCL2／CCR2與組織損傷和自身免疫性疾病密切相關(guān)［2］，而近年來發(fā)現(xiàn)CCL2／CCR2在神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛發(fā)生發(fā)展中有重要的作用［3］。本課題組在以往的實(shí)驗(yàn)研究中已證實(shí)，在大鼠骨癌痛模型上趨化因子CCL2及其受體CCR2在脊髓水平表達(dá)明顯增高［4－5］，且鞘內(nèi)應(yīng)用CCL2中和抗體后能有效地緩解大鼠骨癌痛［6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠骨癌痛模型，鞘內(nèi)應(yīng)用CCR2特異性抑制劑RS102895后，觀察大鼠機(jī)械痛閾值和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖的變化情況，探討CCR2在骨癌痛中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Walker256細(xì)胞（南京中醫(yī)藥大學(xué)新藥與海洋藥物研究中心藥理毒理研究室惠贈(zèng)）；動(dòng)態(tài)足底觸覺儀（Ugo Basile公司，意大利）；RS102895（Sigma公司，美國）；小鼠抗 GFAP抗體（Sigma公司，美國）；SP試劑盒（北京中杉生物公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♀未交配SD大鼠150～180 g，蘇州格瑞斯威生物科技有限公司提供，使用許可證號(hào)SCXK（蘇）2009－0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度保持為（22～24）℃，濕度40%～60%，光照周期為8∶00～20∶00，大鼠自由飲水、進(jìn)食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨癌痛模型的制備 參照姚明等［7］介紹的方法建立脛骨癌痛模型。大鼠腹腔內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞，7～14 d可出現(xiàn)大量腹水。局部消毒后直接經(jīng)腹腔抽取腹水10 ml，經(jīng)Hank′s液洗滌后并除去紅細(xì)胞，濃縮細(xì)胞濃度約2×1010·L－1。大鼠于腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，在左脛骨上段膝關(guān)節(jié)下切開約5 mm小口，鈍性分離肌肉等組織后暴露脛骨干骺端，然后用牙科探針在脛骨干骺端鉆孔，接著用微量注射器，注入10μl腫瘤細(xì)胞（1×105）混懸液，并用醫(yī)用膠水封堵針孔。外涂紅霉素眼膏防止傷口感染。假手術(shù)組僅注入Hank′s液10μl。

1.3.2 蛛網(wǎng)膜下腔置管 參照楊建平等［8］改良后的方法進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管，在大鼠腹腔注射4%水合氯醛400 mg·kg－1麻醉后進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管，大鼠清醒后，剔除出現(xiàn)肢體感覺或運(yùn)動(dòng)障礙、導(dǎo)管脫出的大鼠，且經(jīng)導(dǎo)管注射2%利多卡因10μl，如注射后30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹說明導(dǎo)管位置正確。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組（n＝8）：假手術(shù)組（I組）、假手術(shù) ＋RS102895（Ⅱ組）、骨癌痛組（Ⅲ組）、骨癌痛＋DMSO組（Ⅳ組）、骨癌痛＋RS102895組（Ⅴ組）。假手術(shù)組在脛骨干骺端骨髓腔內(nèi)注入Hank′s液10μl，而骨癌痛組注入Walker256乳腺癌細(xì)胞（1×105）混懸液10μl。在造模后10～12 d，Ⅱ、Ⅴ組大鼠鞘內(nèi)連續(xù)注射CCR2特異性拮抗劑RS102895，每天1次，每次10μl，濃度為3 g·L－1，Ⅳ組大鼠鞘內(nèi)則每次給予 10%DMSO 10μl。

1.4 機(jī)械痛閾的測(cè)定 各組大鼠于術(shù)前1 d，術(shù)后3、6、9、10、11、12 d分別測(cè)定機(jī)械痛閾。將大鼠放入底部為鐵絲網(wǎng)的有機(jī)玻璃籠中30 min，待其安靜并適應(yīng)周圍環(huán)境后進(jìn)行測(cè)量。利用動(dòng)態(tài)足底觸覺儀的觸覺刺激針刺激大鼠后肢足底，每只大鼠足底取3個(gè)不同位點(diǎn)，讀取并記錄儀器顯示的縮爪時(shí)的作用壓力值即為機(jī)械痛閾。每次測(cè)量間隔5 min，取其平均值。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠造模后12 d麻醉后各處死4只大鼠，迅速暴露其心臟并經(jīng)升主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水200 ml以沖凈血液，隨即灌注4%多聚甲醛緩沖液300 ml。取 L4－6脊髓段，置于4%多聚甲醛中后固定4～6 h（4℃），再浸于20%蔗糖溶液中4℃過夜直至沉底。行冰凍冠狀連續(xù)切片，脊髓切片厚約25μm。切片收集于0.01 mol·L－1的PBS中，在室溫下行PBS沖洗5 min×3次，用SP法免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記GFAP。組織切片經(jīng)過3%氧化氫及正常山羊血清孵育后，滴加小鼠抗GFAP多克隆抗體（1∶500），4℃濕盒孵育24 h～48 h；生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG常溫下孵育2 h；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，常溫下孵育2h；DAB顯色，并用酒精梯度脫水，二甲苯透明處理，最后中性樹膠封片。用PBS代替一抗或二抗作陰性對(duì)照。切片用照相機(jī)拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析脊髓背角染色陽性細(xì)胞數(shù)（Num）和平均光密度值（MOD）。每例標(biāo)本取4張GFAP表達(dá)最明顯的切片，并取其平均光密度的平均值作為該標(biāo)本的測(cè)量值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以ˉx±s表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機(jī)械痛閾值的測(cè)定 各組大鼠基礎(chǔ)痛閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；于造模后6～12 d，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠痛閾值進(jìn)行性下降（P＜0.01），且與Ⅰ組相比，同時(shí)點(diǎn)痛閾值明顯降低（P＜0.01）；與Ⅲ、Ⅳ組大鼠相比，Ⅴ組大鼠的機(jī)械痛閾值在造模后10～12 d明顯升高（P＜0.01）。見Fig 1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 與Ⅰ組相比，術(shù)后12 d，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加，脊髓GFAP染色明顯加深，平均光密度值（mean optical density，MOD）明顯增加（P＜0.01），且細(xì)胞胞體肥大，突起減少，細(xì)胞呈“活躍”態(tài)；Ⅱ組上述指標(biāo)無明顯變化。與Ⅲ組相比，Ⅴ組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，脊髓GFAP染色變淺，MOD值減少（P＜0.01），且細(xì)胞胞體減小，突起增多；Ⅳ上述指標(biāo)無明顯變化。見Tab 1，F(xiàn)ig 2。

Fig 1 Changes of PWT in different time points before and after model establishment（xˉ±s，n＝8）

Tab 1 Expression of GFAP in the spinal cord of different groups（ˉx±s，n＝4）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將大鼠源Walker256乳腺癌細(xì)胞接種于同系SD大鼠脛骨干骺端制備骨癌痛模型，術(shù)后d 6開始，大鼠出現(xiàn)進(jìn)行性機(jī)械痛閾下降，活動(dòng)度減少，到后期不能負(fù)重甚至拖地而行，提示脛骨癌痛模型建立成功。

CCL2是趨化因子CC家族成員，根據(jù)其功能作用又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1（macrophage chemotactic protein-1），而CCR2是其高選擇性、高親和性的受體。以往研究已證實(shí)，將小鼠CCR2基因敲除后并不產(chǎn)生機(jī)械超敏現(xiàn)象［9］，而在神經(jīng)病理性疼痛模型中，鞘內(nèi)應(yīng)用 CCR2的拮抗劑可以緩解疼痛［10］。本課題組免疫熒光發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CCR2主要分布在大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上，且在大鼠骨癌痛模型上脊髓水平表達(dá)明顯增高［5］。

在本實(shí)驗(yàn)中，觀察到大鼠在術(shù)后d 6機(jī)械痛閾明顯降低，并持續(xù)降低至術(shù)后12 d，而鞘內(nèi)應(yīng)用CCR2特異性拮抗劑RS102895及其溶劑10%DMSO發(fā)現(xiàn)，CCR2拮抗劑能夠有效的緩解大鼠骨癌痛，提高大鼠機(jī)械痛閾值，并能明顯抑制大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而骨癌痛大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活，與癌痛的維持過程密切相關(guān)［11－12］。因此CCR2對(duì)于骨癌痛的維持具有重要作用。根據(jù)以上研究我們推測(cè)，在骨癌痛大鼠模型上，各種傷害性刺激，包括腫瘤的壓迫、骨質(zhì)的破壞以及腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的傷害性物質(zhì)引起脊髓CCL2的表達(dá)增高，大量分泌的CCL2與小膠質(zhì)細(xì)胞上的CCR2受體相結(jié)合并通過信號(hào)傳導(dǎo)通路引起小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，這些活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，因而進(jìn)一步促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞互相激活協(xié)同，釋放各種神經(jīng)致敏物質(zhì)，最終引起神經(jīng)元興奮性提高，使其去極化，導(dǎo)致中樞敏化的產(chǎn)生，引發(fā)痛覺過敏，形成疼痛的正反饋效應(yīng)，使慢性骨癌痛持續(xù)存在。

綜上所述，CCR2可能通過脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與骨癌痛，CCR2可能成為慢性疼痛的潛在治療靶點(diǎn)。

Fig 2 Expression of GFAP in the spinal cord of different groups（ˉx±s，n＝4）

參考文獻(xiàn)：

［1］ Old E A，Malcangio M.Chemokine mediated neuron-glia communication and aberrant signalling in neuropathic pain states［J］.Curr Opin Pharmacol，2012，12（1）：67－73.

［2］ Mahad D J，Ransohoff R M.The role of MCP-1（CCL2）and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）［C］／／Seminars in immunology.Academic Press，2003，15（1）：23－32.

［3］ Thacker M A，Clark A K，Bishop T，et al.CCL2 is a key mediator of microglia activation in neuropathic pain states［J］.Eur J Pain，2009，13（3）：263－72.

［4］ Hu JH，Zheng X Y，Yang JP，et al.Involvement of spinal monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）in cancer-induced bone pain in rats［J］.Neurosci Lett，2012，517（1）：60－3.

［5］ Hu J H，Wu M Y，Tao M，Yang JP.Changes in protein expression and distribution of spinal CCR2 in a rat model of bone cancer pain［J］.Brain Res，2013，1509：1－7.

［6］ 鄭曉艷，楊建平，胡計(jì)嬅，等.大鼠鞘內(nèi)注射MCP-1中和抗體緩解骨癌痛［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：769－72.

［6］ Zhen X Y，Yang JP，Hu JH，et al.Intrathecal injection of neutralizing antibody of MCP-1 attenuates bone cancer pain［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（6）：769－72.

［7］ 姚 明，楊建平，王麗娜，等.腹水傳代與體外培養(yǎng)Walker256癌細(xì)胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88：880－4.

［7］ Yao M，Yang J P，Wang L N，et al.Feasibility of establishment of rat model of bone cancer pain by using Walker 256 cells cultured in vitro or in vivo［J］.Natl Med J China，2008，88（13）：880－4.

［8］ 楊建平，蔣 豪，吳 玨.大鼠蛛網(wǎng)膜下腔埋管并長期留置操作的改進(jìn)［J］.中華麻醉學(xué)雜志，1993，13（2）：110.

［8］ Yang J P，Jiang H，Wu J.Improvement of burying and detaining tube for long time in rat subarachnoid space［J］.Chin J Anesthesiol，1993，13（2）：110.

［9］ Zhang J，Shi X Q，Echeverry S，et al.Expression of CCR2 in both resident and bone marrow-derived microglia plays a critical role in neuropathic pain［J］.J Neurosci，2007，27（45）：12396－406.

［10］Serrano A，ParéM，McIntosh F，et al.Blocking spinal CCR2 with AZ889 reversed hyperalgesia in a model of neuropathic pain［J］.Mol Pain，2010，6：90.

［11］Cao F，Tian Y K.Impacts of systemic morphine treatment on the spinal glia in the rat model of bone cancer pain［J］.Anesthesiology，2008，109：A753.

［12］Wieseler-Frank J，Maier S F，Watkins L R.Glial activation and pathological pain［J］.Neurochem International，2004，45（2）：389－95.