大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用*

劉漪淪,鄧峰美,劉衛(wèi)華,羅永慧,趙寧寧,劉海榮,劉月明,王航宇

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科,成都 610500;2.成都醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,成都 610500;3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研實驗中心,成都 610500;4.石河子大學(xué)藥學(xué)院,石河子 832002;5.教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室,石河子 832002)

·皮膚性病藥物專欄·

大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用*

劉漪淪1,鄧峰美2,劉衛(wèi)華3,羅永慧1,趙寧寧1,劉海榮3,劉月明1,王航宇4,5

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科,成都 610500;2.成都醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,成都 610500;3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研實驗中心,成都 610500;4.石河子大學(xué)藥學(xué)院,石河子 832002;5.教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室,石河子 832002)

目的 探討大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSFs)的作用及其機制。方法分別以終濃度為0,20,40, 80μmol·L-1的大黃素處理HSFs,以MTS法檢測細(xì)胞活力,以Annexin V、碘化丙啶雙染法行流式細(xì)胞儀檢測,以Western blot法檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)及其磷酸化蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、髓樣細(xì)胞白血病-1(Mcl-1)、受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)的表達(dá)。結(jié)果大黃素對HSFs的增殖活力有抑制作用,且呈劑量依賴性;HSFs在終濃度為40,80μmol·L-1大黃素作用48 h后死亡率分別為28.6%,68.0%(P＜0.01),以泛caspase抑制藥Z-VAD-FMK預(yù)處理能夠部分降低大黃素所致細(xì)胞死亡率(P＜0.05);大黃素能夠抑制ERK磷酸化、Mcl-1和RIP1的表達(dá)。結(jié)論大黃素能夠抑制HSFs的增殖活力、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,其機制可能與其抑制ERK1/2磷酸化及Mcl-1、RIP1蛋白表達(dá)有關(guān)。

大黃素;瘢痕,增生性;成纖維細(xì)胞;細(xì)胞死亡

增生性瘢痕是創(chuàng)傷后組織過度修復(fù)的表現(xiàn),瘢痕發(fā)生的機制至今不明確。臨床上治療有效的藥物主要有糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥等,但療效欠佳。從中草藥中篩選出療效確切、副作用小的抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的有效藥物,具有較大的臨床應(yīng)用價值。中藥治療增生性瘢痕有悠久的歷史。多種中藥成分能夠在體內(nèi)或體外模型中抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖及分泌功能,但多數(shù)軟堅散結(jié)中藥的藥效成分不明確[1-2]。大黃素(emodin)是多種植物根莖中含有的天然蒽醌衍生物,具有酪氨酸激酶抑制的作用,在一些腫瘤細(xì)胞中能夠抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)磷酸化,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSFs)的增殖具有一定抑制作用[5],但機制尚不明確。因此筆者在本實驗中探討大黃素對HSFs的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、Ⅰ型膠原酶、G418購自美國Gibco公司(批號依次為1255136, 1551835,1374941,1243389,1387741,1444515),中性蛋白酶DispaseⅡ購自Roche公司(批號: 04942078001),大黃素購自Sigma公司(批號:E7881,質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%),Z-VAD-FMK(Z-VAD)購自Promega公司(批號:G7231),Annexin V-FITC、碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司(批號:556547),細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)及其磷酸化蛋白p-ERK1/2、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的單克隆抗體購自Cell Signaling公司(批號:9107,4370,2876),髓樣細(xì)胞白血病-1 (myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)單克隆抗體購自Abcam公司(批號:ab32087),受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein1,RIP1)多克隆抗體購自Santa Cruz公司(批號:sc-7881)?；瘜W(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)為日本FUJIFILM公司FUJIFILM LAS-4000,流式細(xì)胞儀為美國BD公司AccuriTMC6系統(tǒng)。

1.2 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)與實驗分組 經(jīng)醫(yī)院倫理道德與科研委員會批準(zhǔn),患者知情同意后選取深Ⅱ度燒傷后增生性瘢痕患者5例,均為漢族,其中男3例,女2例,年齡23～55歲,均無結(jié)締組織疾病及心、肺、肝、腎臟等慢性疾病,未使用過類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物,未接受過放療,傷后3～8個月在我院行瘢痕切除與修復(fù)術(shù)。瘢痕處于增生期,外觀發(fā)紅充血、質(zhì)硬、高于皮面＞1 cm,表面無破潰,瘢痕局限于皮損區(qū),局部瘙癢。標(biāo)本取自頸、胸、手部的增生性瘢痕組織,經(jīng)病理學(xué)確診。以0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)將標(biāo)本洗滌干凈,將組織塊修剪為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,浸泡于0.25%DispaseⅡ中,置于37℃恒溫?fù)u床2 h;然后將組織塊轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,用0.1 mol·L-1PBS洗滌3次,小心剝?nèi)ケ砥?反復(fù)洗滌真皮,再用眼科剪將其充分剪碎,約1 mm3大小,接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),在二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)4～5 h,使其較牢固地粘附于瓶壁,隨后加入含10%FBS的DMEM液,繼續(xù)培養(yǎng),每3 d進(jìn)行1次換液,待原代細(xì)胞生長成單層融合后,按1∶2或1∶3的比例分瓶傳代。實驗時應(yīng)用第4～6代細(xì)胞。根據(jù)培養(yǎng)液中加入大黃素的終濃度,設(shè)0μmol·L-1(對照組)、20μmol·L-1組、40μmol·L-1組和80μmol·L-1組,同時在進(jìn)行流式檢測時,設(shè)立泛caspase抑制藥Z-VAD-FMK預(yù)處理組,在加入不同濃度大黃素之前1 h加入終濃度為20μmol·L-1的ZVAD-FMK。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞活力檢測 將對數(shù)生長期的HSFs以每孔5 000個接種于96孔板,24 h后按上述分組進(jìn)行換液加藥處理,48 h后每孔加入MTS溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶標(biāo)儀上測定490 nm吸光度值,并計算相對細(xì)胞活力值(樣品吸光度值/對照吸光度值× 100%)。

1.3.2 細(xì)胞死亡檢測 采用流式細(xì)胞儀,以Annexin V、PI雙染法對細(xì)胞進(jìn)行檢測。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×105個·mL-1接種于24孔板,每組設(shè)復(fù)孔3個,24 h后換液,加入藥物處理,48 h后胰酶消化獲取細(xì)胞,移入流式管中,1 500 r·min-1(r=15 cm)離心5 min,棄上清液,預(yù)冷PBS每管1 mL洗滌2次,結(jié)合緩沖液每管1 mL洗滌1次,每次均1 500 r·min-1(r= 15 cm)離心5 min,結(jié)合緩沖液100μL重懸細(xì)胞,依次加入Annexin V、PI各5μL,震蕩混勻,靜置15min后加入400μL結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)完成流式檢測。

1.3.3 Western blot法檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞分別以4×105個接種于6孔板,24 h后胰酶消化,收集細(xì)胞于離心管中,預(yù)冷PBS洗2次,棄上清液,加入細(xì)胞裂解液,冰上孵育30 min,期間震蕩3次, 13 000 r·min-1(r=8 cm)離心30 min,取上清液進(jìn)行蛋白定量,每樣本取30μg總蛋白量在分離膠濃度為10%的條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)117 V 90～110 min,轉(zhuǎn)膜50 V 90 min,轉(zhuǎn)印后的PVDF膜以5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,含聚山梨酯-20的Tris鹽緩沖液(tris buffered saline with tween-20,TBST)洗膜3次,每次20 min,二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,每次20 min,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液孵育4 min,透明薄膜密封,以FUJIFILM LAS-4000成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光及定量檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對HSFs細(xì)胞活力的影響 在終濃度為0 (對照組),20,40及80μmol·L-1大黃素作用下,HSFs相對細(xì)胞活力呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,其中,大黃素40,80 μmol·L-1組細(xì)胞活力下降較為顯著,分別下降達(dá)45.2%,79.0%(P＜0.05)。見圖1。

圖1 大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of emodin on cell viability of HSFs

2.2 大黃素對HSFs細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用 流式細(xì)胞儀Annexin V、PI雙染檢測的結(jié)果顯示,HSFs在終濃度為40,80μmol·L-1大黃素48 h作用下死亡率分別為28.6%,68.0%,高于對照組(P＜0.01),而20μmol·L-1大黃素對HSFs的影響與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。20μmol·L-1Z-VAD-FMK對HSFs的影響同對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;Z-VAD-FMK預(yù)處理能夠部分降低大黃素(40,80μmol·L-1組)所致的死亡率(P＜0.05)。流式細(xì)胞點陣圖顯示,大黃素40,80μmol·L-1組細(xì)胞的死亡,小部分為AnnexinV陽性,提示為早期凋亡;大部分為Annexin V、PI雙陽性,一般認(rèn)為其存在晚期凋亡或壞死等模式。見圖2。

2.3 大黃素對HSFs ERK1/2磷酸化的作用 Western blot檢測結(jié)果顯示,在終濃度為0,20,40, 80μmol·L-1大黃素作用下,ERK1/2的表達(dá)無變化, p-ERK1/2的表達(dá)出現(xiàn)遞減,蛋白水平依次下降達(dá)80.0%(P＜0.01)。見圖3。

2.4 大黃素對HSFs Bcl-2、Mcl-1及RIP1的影響 Bcl-2的表達(dá)在不同濃度大黃素作用下沒有顯示出明顯的變化趨勢,而Mcl-1的表達(dá)在大黃素(20,40, 80μmol·L-1組)作用下明顯減弱,下降均超過50.0% (P＜0.01),但沒有出現(xiàn)線性的趨勢。RIP1的表達(dá)隨著大黃素濃度的增加而逐漸減少,其中,80μmol·L-1組下降超過60.0%(P＜0.01)。見圖4。

3 討論

圖2 Z-VAD-FM K部分抑制大黃素誘導(dǎo)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞死亡A.流式細(xì)胞儀點陣圖,M即mol·L-1;B.細(xì)胞死亡率分析;與大黃素0μmol·L-1組比較,*1P＜0.01;與相應(yīng)無Z-VAD-FMK組比較,*2P＜0.05Fig.2 Partial inhibition of Z-VAD-FMK on emodin-induced cell death of HSFsA.representative flow cytometry dot plots,M(mol·L-1);B.summary data demonstrating analysis of cell death following a 48 h exposure to the indicated drugs;compared with emodin 0μmol·L-1group,*1P＜0.01;compared with non-Z-VAD-FMK group respectively,*2P＜0.05

圖3 大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK1/2磷酸化的影響Fig.3 Effect of emodin on ERK 1/2 phosphorylation of HSFs

圖4 大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Bcl-2、M cl-1與RIP1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of em odin on the expression of Bcl-2,M cl-1 and RIP1 of HSFs

大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基)是大黃、虎杖、何首烏、望江南、砂仁及百合等多種中藥中存在的有效成分,分子式為C15H10O5,相對分子質(zhì)量為270.24。在增生性瘢痕的研究方面,夏珊等[5]發(fā)現(xiàn)大黃素能夠阻滯人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖,并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其改變細(xì)胞增殖/凋亡的機制可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)超載有關(guān)。作為一種酪氨酸激酶抑制藥,大黃素已被發(fā)現(xiàn)能夠抑制ERK1/2磷酸化而發(fā)揮抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖活力的作用,那么其對HSFs是否也存在相應(yīng)的抑制作用呢?ERK1/2磷酸化,主要通過Ras/Raf/MEK/ERK這一通路來進(jìn)行,而后者是細(xì)胞維持活力、保持增殖穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)[6]。若抑制此通路,可抑制細(xì)胞生長,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;而過度激活此通路,則可刺激細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化甚至癌變。本研究表明,大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK1/2磷酸化具有抑制作用,且呈劑量依賴性;另外,與夏珊等[5]研究一致,筆者發(fā)現(xiàn)大黃素對HSFs的活力抑制亦存在劑量依賴性。表明大黃素對HSFs的抑制可能與其抑制ERK1/2磷酸化水平有關(guān)。

大黃素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上和多柔比星、柔紅霉素等抗癌藥物一樣,同屬于蒽醌類化合物,對某些腫瘤細(xì)胞系如肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等,具有一定的誘導(dǎo)凋亡的作用[7-9],結(jié)合上述大黃素在抑制ERK1/2磷酸化方面的作用,筆者認(rèn)為大黃素對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)是一個復(fù)雜的多種機制并存的體系。細(xì)胞的程序性死亡是目前人們較為關(guān)注的方向,包括凋亡、程序性壞死等。本研究一方面通過PI、Annexin V雙染法初步判斷細(xì)胞早期凋亡或壞死的情況,同時應(yīng)用泛caspase抑制藥-Z-VADFMK,一種凋亡抑制劑[10],進(jìn)一步分析細(xì)胞死亡的形式;另一方面,筆者選擇Bcl-2、Mcl-1這兩個常見的抗凋亡蛋白以及RIP1這一與細(xì)胞程序性壞死相關(guān)的蛋白進(jìn)行檢測,初步探討大黃素誘導(dǎo)HSFs死亡過程可能的機制。結(jié)果表明,大黃素所致的死亡細(xì)胞中,小部分呈Annexin V陽性,提示其早期凋亡,而大部分為PI、Annexin V雙陽性,認(rèn)為存在晚期凋亡或壞死等可能[11-13]。而Z-VAD-FMK對大黃素組細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,在40和80μmol·L-1組,均部分阻斷細(xì)胞的死亡。這兩方面證據(jù)提示大黃素導(dǎo)致的細(xì)胞死亡不僅僅只有細(xì)胞凋亡,還包含其他死亡模式。

Bcl-2與Mcl-1是Bcl-2家族的成員,具有抗凋亡的作用[14-15]。在本實驗中,大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)起到抑制作用,而對Bcl-2的表達(dá)并沒有表現(xiàn)出有意義的調(diào)控作用,提示大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)可能與Mcl-1的調(diào)控有關(guān)。在本實驗中大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Mcl-1表達(dá)的抑制無劑量依賴的關(guān)系,可能是由于大黃素作用濃度的范圍或者是其他因素造成,需要進(jìn)一步證實。

RIP1是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞存活及細(xì)胞程序性壞死等信號傳導(dǎo)中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn),RIP1是決定細(xì)胞生死的重要節(jié)點[16]。在本實驗中,增生性瘢痕成纖維細(xì)胞RIP1的表達(dá),在大黃素的作用下表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制,提示大黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)作用與RIP1的改變具有一定關(guān)聯(lián),這對今后研究大黃素的作用具有很大的啟發(fā)。另外,p-ERK1/2與RIP1的變化呈現(xiàn)相同的劑量依賴性趨勢,它們之間存在什么樣的調(diào)控關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.007

Effect of Emodin on Hypertrophic Scar Fibroblasts

LIU Yi-lun1,DENG Feng-mei2,LIUWei-hua3,LUO Yong-hui1,ZHAO Ning-ning1,LIU Hai-rong3,LIU Yueming1,WANG Hang-yu4,5
(1.Department of Burns and Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;2.Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;3.Experiment Research Center,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500,China;4.School ofPharmacy,Shihezi University,Shihezi 832002,China;5.Key Laboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM,Shihezi 832002,China)

Objective To investigate the effect of emodin on hypertrophic scar fibroblasts(HSFs)and explore the underlyingmechanism.MethodsHSFs were treated by emodin at final concentrations of 0,20,40,and 80μmol·L-1, respectively,in the culturalmedia.Forty-eight hours later,the cells were subjected to MTS assay and flow cytometry assay with annexin V and propidium iodide as dyeing indicators.Whole cell lysates from the cells of every group were subjected to Western blotting tomeasure the protein expression levels of ERK1/2,Bcl-2,Mcl-1 and RIP1.ResultsThe cell viability of HSFs was inhibited by emodin in a dose dependentmanner.Themortality rate of HSFs treated with emodin for48 h at the concentrations of 40 and 80μmol·L-1were 28.6%and 68.0%,respectively,which was significantly higher than that of the control group(P＜0.01).Pretreatmentwith Z-VAD-FMK could partially reduce the mortality caused by emodin(P＜0.05).Phosphorylation of ERK1/2 and the expression of RIP1 and Mcl-1 were inhibited by emodin.ConclusionDown regulation of ERK1/2,RIP1 and Mcl-1 by emodin may account for the inhibited proliferation and increased cell death of HSFs.

Emodin;Scar,hypertrophic;Fibroblast;Cell death

R285.6;R619.6

A

1004-0781(2014)12-1566-05

2014-06-23

2014-08-13

*國家自然科學(xué)基金資助面上項目( 30672175);四川省衛(wèi)生廳科研項目(100103);成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷外科學(xué)四川省醫(yī)學(xué)重點學(xué)科專項科研基金資助項目(SSZDXK-001)

劉漪淪(1972-),男,安徽霍邱人,副主任醫(yī)師,副教授,碩士,研究方向:瘢痕防治與組織再生。電話:(0) 18227672279,E-mail:thirdforce@163.com。

王航宇(1968-),男,新疆石河子人,副教授,碩士,研究方向:中藥和天然藥物研究。電話:(0)18909932852, E-mail:18909932852@189.cn。