復發(fā)性流產患者主動免疫治療后淋巴細胞免疫表型的變化

趙花，韋相才。，鐘興明，苗竹林＊，秦衛(wèi)兵

（1．暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣州 510632；2．廣東省計劃生育科學技術研究所，廣州 510600）

復發(fā)性流產是指連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產［1］，其在育齡夫婦中的發(fā)病率約1%～5%。目前仍有50%以上的患者病因不明，稱為原因不明復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），臨床上治療困難。而淋巴細胞主動免疫療法（lymphocyte immunotherapy，LIT）是目前臨床上為URSA患者最常用的治療方法之一，其治療成功率約76%～90%［2－4］。國內外學者對其作用機制進行了大量的研究，但仍未完全明確。如何對LIT效果進行評估國內外尚無定論，目前臨床上主要以封閉抗體（blocking antibody，BA）作為主動免疫療效的監(jiān)測指標，雖然具有一定的指導意義，但BA轉陽的患者再次妊娠后仍可發(fā)生流產。能否探尋一些更有價值的指標來評估治療效果、指導治療，這也是國內外學者正積極探討的問題之一。本文通過分析URSA患者LIT前后BA及其外周血淋巴細胞免疫表型的變化，隨訪其妊娠結局，探討其可能的作用機制，并為臨床療效評價尋找新的參考指標。

資料與方法

一、研究對象

選自2012年2月至2013年8月廣東省計劃生育科學技術研究所生殖免疫門診URSA患者，年齡21～38歲，經夫婦雙方簽字知情同意書后行主動免疫治療。經過詳細的病因篩查，排除解剖、感染、遺傳、生殖內分泌及自身免疫異常，所有病例均為BA陰性者，診斷為URSA。所有入選對象半年內均未接受過激素及免疫調節(jié)治療，治療過程中妊娠者及未完成一療程治療者予以剔除，最終納入25例。

二、研究方法

1．主動免疫治療方法：（1）淋巴細胞來源：URSA患者丈夫需經乙肝、丙肝病毒系列檢查以及肝功能、人類免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋體、生化、血脂等篩查，正常者方可供血；異常者重新挑選健康第三方提供血源。（2）治療方法：抽取URSA患者丈夫或健康的無關第三者空腹血30ml，與等量生理鹽水混合，在無菌條件下常規(guī)分離提取淋巴細胞，用生理鹽水洗滌3次后，調整淋巴細胞混懸液約0．7ml。于患者前臂內側分3點皮內注射，每2周治療1次，4次為1個療程。分別于治療前及1個療程結束后2周，用真空肝素鈉抗凝管或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集外周靜脈血2ml，室溫放置。檢測患者淋巴細胞免疫表型，同時復查BA。

2．BA檢測方法：抽取患者外周血2ml，分離血清于－20℃保存?zhèn)溆?。用酶?lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行測定，按ELISA試劑盒（One lambda，美國）說明書進行操作。

3．實驗試劑及步驟：采用FACS calibur流式細胞儀（Becton Dickinson，美國），F(xiàn)ACS lysing solution、Tritest CD4FITC／CD8PE／CD3Per-CP鼠抗人 三 色 熒 光 抗 體、Anti-HLA-DR APC、CD16 FITC、CD56PE、CD3PerCP、CD69APC、CD25 FITC、CD127PE、CD4APC、CD5PerCP-CY5．5、CD19FITC鼠抗人熒光抗體（BD，美國）。分設試驗管和對照管，各取50μl外周血，按試劑說明書加入相應抗體，混勻，室溫（20～25℃）避光孵育15min。加入450μl 1×FACS lysing solution輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光孵育15min，加入2ml PBS，混勻，1 200r／min離心5min，去上清。300μl PBS重懸，流式細胞儀上機檢測。

4．數據獲?。菏褂妹绹鳦ELLQuest軟件，用前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）設閾值，排除碎片干擾；在散點圖SSC／FSC中圈出淋巴細胞作為分析對象，然后在散點圖中分析各淋巴細胞亞群的比例。使用CELLQuest軟件分析結果。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、BA變化及妊娠結局

治療前25例患者BA均呈陰性，LIT一療程后21例陽性，陽性率84%。其余4例未轉為陽性的患者經過繼續(xù)加強治療后均轉為陽性。25例患者成功妊娠16例（已正常分娩或妊娠至孕20周后），4例再次流產。

二、治療前后T細胞及Treg細胞表型變化

治療后CD3＋T細胞的比例增加，CD4＋T細胞的比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；治療前后表面活化標志HLA-DR在CD3＋、CD8＋T細胞中的表達并無顯著性差異，但CD4＋T細胞活化的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而CD4＋CD25＋CD127dimTreg細胞占CD4＋T細胞比例治療前后并無明顯變化（P＞0．05）（表1，表2）。

三、治療前后B淋巴細胞表型變化

主動免疫治療后外周血CD19＋B細胞的比例及CD5＋B、CD5－B細胞在淋巴細胞和B細胞中的比例均無顯著變化（P＞0．05）（表3）。

四、治療前后NK細胞表型變化

主動免疫治療后URSA患者外周血CD3－CD56＋NK細胞占淋巴細胞的比例顯著下降（P＜0．01）（表4）。

五、妊娠成功組治療前后淋巴細胞免疫表型變化

妊娠成功組治療前后CD3－CD56＋NK細胞、CD3＋T、CD4＋T及CD4＋HLA-DR＋T細胞比例均有顯著變化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）（表5）。

表1 主動免疫治療前后外周血T淋巴細胞表型變化［（±s）%］

表1 主動免疫治療前后外周血T淋巴細胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊P＜0．05

組 別 例數 CD3＋T CD4＋T CD8＋T CD4＋／CD8＋治療前 25 62．56±9．72 49．21±11．37 34．84±9．81 1．38±0．44治療后 25 68．44±8．61＊ 44．35±12．63＊37．63±12．95 1．17±0．46

表2 主動免疫治療前后外周血活化T淋巴細胞及Treg細胞變化［（±s）%］

表2 主動免疫治療前后外周血活化T淋巴細胞及Treg細胞變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊P＜0．05

組 別 例數 CD3＋HLA-DR＋／CD3＋ CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD8＋HLA-DR＋／CD8＋ CD4＋CD25＋CD127dimTreg治療前 25 25．52±9．87 12．03±5．96 30．00±12．11 6．21±1．78治療后 25 27．32±11．55 16．33±7．01＊29．10±14．61 6．67±1．70

表3 主動免疫治療前后B淋巴細胞表型變化［（±s）%］

表3 主動免疫治療前后B淋巴細胞表型變化［（±s）%］

注：治療前后比較，P均＞0．05

組 別 例數 CD19＋B CD5＋CD19＋B CD5－CD19＋B CD5＋CD19＋／B CD5－CD19＋／B治療前 25 11．13±4．10 3．96±1．86 7．43±2．72 32．85±9．06 66．66±9．17治療后 25 10．81±3．30 3．73±1．65 7．41±2．88 29．66±8．00 70．34±8．00

表4 主動免疫治療前后NK細胞表型變化［（±s）%］

表4 主動免疫治療前后NK細胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊＊P＜0．01

組 別 例數 CD3－CD56＋NK CD3＋CD56＋NKT CD56dimCD16＋NK CD56bright CD16－NK CD56＋CD69＋NK治療前 25 13．48±3．00 5．20±4．19 87．40±7．72 3．92±2．64 3．83±0．78治療后 25 10．09±2．42＊＊5．17±4．58 89．19±6．46 3．81±1．94 3．67±0．83

表5 主動免疫治療前后妊娠成功組淋巴細胞表型變化［（±s）%］

表5 主動免疫治療前后妊娠成功組淋巴細胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊＊P＜0．01

組 別 例數 CD3＋T CD4＋T CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD3－CD56＋NK治療前 16 50．06±8．88 50．86±10．96 10．91±5．79 15．18±2．25治療后 16 68．47±8．59＊＊ 43．13±12．89＊＊ 16．93±5．61＊＊ 10．15±2．63＊＊

討 論

主動免疫治療應用于臨床多年，國內外對其療效一直存在爭議［5－6］，尚無明確的療效評價指標。本研究通過LIT前后患者外周血T細胞、B細胞、自然殺傷細胞（natural killer，NK）和Treg細胞免疫表型的變化進行觀察，探討了LIT可能的作用機制，并為主動免疫療效評價探尋了新的參考指標。

本文25例URSA患者經LIT后21例BA轉陽，陽性率為84%（21／25），與國內報道［7－8］結果相似。楊寧等［9］報道BA陰性的URSA患者經同樣的方法治療1療程后BA陽性率為78．59%（359／444），而妊娠成功率達85．58%（267／312），較傳統(tǒng)保胎組26．67%（4／15）明顯升高。這說明LIT能誘導大部分患者產生BA，明顯提高妊娠成功率。近年來BA一直被認為是LIT療效和成功妊娠的預測指標。然而臨床上一些BA陽性的患者仍會發(fā)生流產，如何更加準確地進行療效監(jiān)測和病情評估，仍是國內外的研究重點，也是本研究的方向。

T淋巴細胞作為外周血中最主要的淋巴細胞，在免疫刺激、免疫調節(jié)、免疫反應中起著重要作用，因此，T細胞亞群的變化也是免疫治療重要的觀察指標之一。在正常妊娠早期，CD8＋T細胞數量增多，CD4＋／CD8＋比值的降低，有利于胚胎免遭母體免疫系統(tǒng)的排斥。而URSA患者外周血CD4＋T細胞比例及CD4＋／CD8＋比值明顯升高，有效治療后則可逆轉［10］。國內外的研究均顯示，URSA患者存在外周血T淋巴細胞亞群比例異常，而主動免疫治療可使T淋巴細胞亞群比例和功能發(fā)生明顯的有利變化。本研究發(fā)現(xiàn)，LIT后CD3＋T細胞比例明顯增加（P＜0．05），與國外研究［11］結果一致。本研究組前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，URSA患者外周血CD4＋T細胞比例較正常婦女明顯升高，而本研究中妊娠成功組CD4＋T細胞比例為（43．13±12．89）%，較治療前［（50．86±10．96）%］明顯下降（P＜0．05），可見LIT能調節(jié)機體的免疫紊亂，CD4＋T細胞的降低有利于妊娠。但本研究中CD4＋／CD8＋比率并無明顯變化，由于本研究選取的樣本量有限，可能導致了部分結果的偏差。此外，URSA患者CD4＋HLADR＋細胞比例較治療前顯著增加。這亦提示，LIT可能主要通過抗原刺激CD4＋T細胞發(fā)揮作用，但其具體作用方式則取決于CD4＋T細胞的分化及其分泌的細胞因子，所以其對妊娠的維持是否有利尚無法定論，仍需進一步研究證實。

NK細胞有細胞毒性效應，占外周血淋巴細胞數量的10%～15%，無需抗原預先致敏就自發(fā)殺傷靶細胞，還可以通過分泌細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用。已有研究表明，NK細胞毒性和數量增加與流產有關［13］，外周血高水平的NK細胞預示染色體核型正常的妊娠可能發(fā)生生化妊娠或自然流產，并發(fā)現(xiàn)早孕期NK細胞活性較未孕時明顯降低，表明減少NK細胞的比例和抑制其活性也許能阻止母體免疫系統(tǒng)對胎兒抗原的攻擊，維持妊娠。本研究中16例成功妊娠患者治療前NK細胞比例為（15．18±2．25）%，治療后明顯降低［（10．15±2．63）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）?？梢?，LIT能明顯降低NK細胞的比例，有利于妊娠。國外有人建議將CD3＋CD56＋NKT細胞的數量作為靜脈注射用免疫球蛋白（IVIG）治療對象的篩選指標，他們發(fā)現(xiàn)NKT細胞升高的患者經IVIG治療后其數量可明顯降低，并且能顯著提高妊娠成功率［14］。本文對NK細胞亞群進行分析發(fā)現(xiàn)，治療前后CD56dim、CD56brightNK亞群在NK細胞中的比例及NK細胞表面活化標志CD69、CD3＋CD56＋NKT細胞的比例并無明顯改變，可能與樣本量有關。因此，檢測NK細胞免疫表型變化有助于URSA婦女病情及預后的監(jiān)測，但人類NK細胞包括許多不同的亞群，很有必要對不同的亞群進行更深入研究分析。

LIT對B淋巴細胞有何影響，至今仍未完全明確。有研究表明，LIT前后CD19＋B、CD5＋CD19＋B細胞比例均無明顯變化［15］，本研究結果與其一致。但他們發(fā)現(xiàn)URSA患者LIT后妊娠成功組CD19＋B細胞明顯增加，提示CD19＋B細胞可能有利于維持妊娠。但其具體作用機制目前仍不明確，是否有利于某些保護性抗體的產生仍需進一步研究。

Treg細胞對免疫耐受具有很強的調節(jié)作用，妊娠期間Treg細胞出現(xiàn)系統(tǒng)擴增，有利于維持正常妊娠。業(yè)已證實，Treg細胞減少可能與URSA密切相關，而LIT能上調CD4＋CD25＋Treg細胞的比例。但Treg細胞缺乏特異的表面標志，有研究發(fā)現(xiàn)CD127的低表達與叉頭蛋白3（FOXP3）的高表達及 CD4＋CD25＋Treg細胞的抑制功能相關［16］?，F(xiàn)已證實CD4＋CD25bright細胞才是人體內真正具有調節(jié)作用的細胞，所以本文聯(lián)合檢測了CD25＋和CD127dim的表達，結果發(fā)現(xiàn)25例URSA患者和16例成功妊娠患者免疫治療前后CD4＋CD25＋CD127dimTreg細胞的比例均無明顯變化，可能與個體免疫反應低下有關，也提示LIT可能并不是通過調節(jié)Treg細胞的水平發(fā)揮療效，但仍需增大樣本進一步證實。

本研究表明，LIT后外周血淋巴細胞免疫表型發(fā)生了明顯的改變，CD3－CD56＋NK 細胞和CD4＋T細胞比例的降低、CD3＋T細胞和活化的CD4＋T細胞的增加也許有利于維持妊娠，檢查T細胞和NK細胞的比例變化有助于URSA婦女病情和療效的監(jiān)測，本文對LIT可能的作用機制進行了深入的探討，也為LIT療效監(jiān)測探尋了新的指標，但仍需要增大樣本量，對妊娠失敗患者進行更深入的對比研究。

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