激素替代治療凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的相關(guān)因素分析

李春燕，明蕾，張露，龔夢(mèng)

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心，武漢430060）

自1983年人類凍融胚胎移植（FET）首次成功妊娠以來，凍融胚胎移植技術(shù)廣泛應(yīng)用于不孕不育輔助生殖領(lǐng)域。凍融胚胎移植常用的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案有3種：自然周期、誘導(dǎo)排卵周期和激素替代周期［1］，激素替代治療方案內(nèi)膜準(zhǔn)備是通過補(bǔ)充外源性的雌、孕激素，促進(jìn)內(nèi)膜的增生與轉(zhuǎn)化，利用B超檢測(cè)子宮內(nèi)膜的形態(tài)及厚度和測(cè)定LH峰來尋找最佳移植窗，主要應(yīng)用于不規(guī)則排卵、排卵障礙及降調(diào)后的患者。雖然自然周期和激素替代治療周期的妊娠率相當(dāng)［2］，但是超排卵后10%～20%的患者會(huì)出現(xiàn)月經(jīng)不規(guī)律或不排卵，且降調(diào)后患者體內(nèi)的激素水平仍處于低水平狀態(tài)，這使得激素替代治療越來越受到人們的關(guān)注［3］。激素替代治療周期中移植窗的選擇是決定妊娠結(jié)局的一重要因素，本文回顧性分析了本中心516個(gè)FET周期的臨床資料，患者的臨床資料，比較激素替代治療凍融胚胎移植患者中妊娠組和非妊娠組之間的受精方式、子宮內(nèi)膜厚度、決定移植日的雌二醇（E2）值、黃體生成素（LH）值及孕酮（P）值之間的差異，同時(shí)進(jìn)一步探討E2水平、子宮內(nèi)膜形態(tài)及LH峰與妊娠的關(guān)系，為臨床尋找最佳移植窗及提高凍胚移植妊娠率提供客觀依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2010年1月至2013年4月在本中心接受凍融胚胎移植治療，年齡＜35歲，平均年齡為（31±2．6）歲，不育原因主要是男方精液異常、女方輸卵管因素和排卵障礙，排除子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤及宮腔粘連和其他可能影響胚胎著床的因素，排除患有內(nèi)分泌疾病患者，共納入516個(gè)周期。

二、研究方法

1．凍融胚胎準(zhǔn)備：采用長(zhǎng)方案、短方案及超長(zhǎng)方案等促排卵方案進(jìn)行超排卵，當(dāng)最大卵泡直徑達(dá)到18mm或同時(shí)3個(gè)卵泡直徑超過16mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，上海麗珠制藥公司）10 000U，34～36h后取卵，卵母細(xì)胞培養(yǎng)2～6h后授精，根據(jù)病情選擇常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI），胚胎培養(yǎng)至取卵后第3天，觀察胚胎發(fā)育情況并在腹部超聲引導(dǎo)下移植，剩余的可利用胚胎冷凍保存。一般冷凍1級(jí)和2級(jí)胚胎，且第2天細(xì)胞數(shù)≥2，第3天細(xì)胞數(shù)≥4；碎片≤20%。根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)，可將早期胚胎劃分為4級(jí)，1級(jí)胚胎為：細(xì)胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片0%～5%之間。2級(jí)胚胎為：細(xì)胞大小略均勻，形態(tài)不規(guī)則；胞質(zhì)可見顆粒現(xiàn)象；碎片10%～20%之間。所有胚胎均進(jìn)行玻璃化快速冷凍，于FET日復(fù)蘇胚胎，胚胎培養(yǎng)4～5h后移植。解凍后胚胎存活的細(xì)胞數(shù)＞50%總細(xì)胞數(shù)，認(rèn)為胚胎存活，可進(jìn)行移植。

2．子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：在未降調(diào)的情況下，自月經(jīng)周期第2天起口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂，先靈，德國）2～4mg／d，7～8d后B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度和激素水平，子宮內(nèi)膜的類型分為以下3種：（1）A型子宮內(nèi)膜：即三線型，B超顯示外層和中央為強(qiáng)回聲線、中間為低回聲；（2）B型子宮內(nèi)膜：B超顯示非均質(zhì)強(qiáng)回聲；（3）C型子宮內(nèi)膜：B超顯示均質(zhì)強(qiáng)回聲。月經(jīng)第12～14天加查E2、LH及P值，結(jié)合子宮內(nèi)膜及激素情況決定移植日。子宮內(nèi)膜至少達(dá)到0．6cm，同時(shí)出現(xiàn)自然LH峰（LH＞10U／L）或者通過注射HCG給予人工LH峰后第2天用黃體酮（黃體酮注射液，天津金耀氨基酸有限公司），每日肌肉注射40～80mg進(jìn)行轉(zhuǎn)化，黃體酮注射后的第3天行胚胎移植，＜35歲者移植2個(gè)胚胎。

3．分組：胚胎移植后第12天測(cè)血HCG≥10U／L為生化妊娠，黃體酮維持治療，孕30d后B超可見胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。將納入的516個(gè)周期根據(jù)結(jié)局分為妊娠組及非妊娠組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者一般情況及受精方式與妊娠結(jié)局的相關(guān)性

納入的516個(gè)周期中獲得臨床妊娠的有246例，其中IVF有148例，ICSI有98例；未著床或者生化妊娠者有270例，其中IVF148例，ICSI 122例；妊娠組的平均年齡為（30±3．2）歲，非妊娠組的平均年齡為（31±2．8）歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0．05。受精方式與妊娠之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析χ2＝1．505，P＞0．05，受精方式與妊娠結(jié)局之間并不存在相關(guān)性。

二、兩組移植日激素水平及子宮內(nèi)膜厚度比較

納入的516個(gè)周期按照妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組，比較兩組間決定移植日的LH值、P值、E2值及子宮內(nèi)膜厚度，無顯著性差異（表1）。

三、移植日不同E2值的妊娠情況的比較

進(jìn)一步討論移植日E2水平與妊娠的關(guān)系，依據(jù)移植日的E2值分為第1組：＜366pmol／L、第2組：366～＜732、第3組：732～＜1 098pmol／L和第4組：＞1 098pmol／L，再將以上4組根據(jù)妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組。用χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果示：移植當(dāng)日的不同的E2水平的妊娠情況進(jìn)行比較；并經(jīng)平衡矯正后第2組與剩余的3組相比，有顯著性差異（P＜0．05）（表2）。

表1 兩組移植日激素水平及子宮內(nèi)膜厚度的比較（±s）

表1 兩組移植日激素水平及子宮內(nèi)膜厚度的比較（±s）

組 別 例數(shù) LH（U／L） E2（pmol／L） P（nmol／L） 內(nèi)膜厚度（cm）妊娠組 246 17．30±14．22 1 300．80±1 506．31 1．55±1．14 0．85±0．13未妊娠組 270 16．71±17．15 1 079．30±1 067．66 1．43±1．14 0．84±0．13

表2 移植日不同E2值的妊娠情況的比較［n，（%）］

四、兩組移植日自然、人工LH峰形成與妊娠的關(guān)系

將516個(gè)周期的分為妊娠組和未妊娠組，統(tǒng)計(jì)兩組之間移植日自然LH峰（LH＞10U／L或者基礎(chǔ)值的2～3倍）和LH峰出現(xiàn)情況，其中LH峰包括自然LH峰（LH＞10U／L）和注射HCG形成的人工LH峰。探討移植日LH峰與妊娠之間的關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，妊娠組和未妊娠組自然LH峰的出現(xiàn)率，顯示χ2＝7．582，P＜0．05；LH 峰出現(xiàn)率（包括自然LH峰和人工LH峰）示χ2＝4．709，P＜0．05，即妊娠組和未妊娠組之間LH峰的出現(xiàn)有顯著性差異（表3）。

表3 兩組移植日自然、人工LH峰形成與妊娠的關(guān)系（%）

五、不同子宮內(nèi)膜厚度的妊娠情況比較

雖然本研究中妊娠組和未妊娠組間的子宮內(nèi)膜厚度不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是依據(jù)文獻(xiàn)［4］提議最合適的子宮內(nèi)膜厚度及結(jié)合本數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，將決定移植日的子宮內(nèi)膜厚度分為＜0．7cm組、0．7～＜0．8cm組、0．8～＜0．9cm組、0．9～＜0．1cm組、1．0～＜1．1cm組及＞1．1cm組，比較各組的妊娠情況，結(jié)果顯示各組之間的妊娠情況無顯著性差異（P＞0．05）（表4）。

六、不同內(nèi)膜類型的妊娠情況比較

依據(jù)本數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，將妊娠組和未妊娠組根據(jù)移植當(dāng)日的子宮內(nèi)膜類型又分為A型及B型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果所得χ2＝8．582，P＜0．05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

表4 不同子宮內(nèi)膜厚度（cm）的妊娠情況比較［n，（%）］

表5 不同內(nèi)膜類型的妊娠情況比較（n）

討 論

影響凍胚移植妊娠率的主要因素包括胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎和子宮內(nèi)膜的同步性［5］。本生殖中心在復(fù)蘇胚胎符合凍胚移植胚胎要求時(shí)行胚胎移植，故認(rèn)為胚胎質(zhì)量不再是影響妊娠結(jié)局的重要因素。內(nèi)膜厚度＜0．6cm或者＞1．4cm胚胎種植率和妊娠率會(huì)顯著性降低，最適子宮內(nèi)膜厚度為0．9～1．4cm［4］。但有學(xué)者認(rèn)為只要內(nèi)膜功能正常，并大于妊娠所需的最低厚度，便可準(zhǔn)備移植［6］。本研究中決定移植日不同子宮內(nèi)膜厚度的妊娠結(jié)局并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于子宮內(nèi)膜形態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)決定移植日以A型子宮內(nèi)膜形態(tài)最佳，妊娠率最高，與李巖等［7］的結(jié)論一致。

本研究中的凍胚移植以補(bǔ)佳樂準(zhǔn)備內(nèi)膜，E2是內(nèi)源性和外源性的共同作用。既往大多數(shù)認(rèn)為決定移植日的E2值越高越有利于妊娠結(jié)局，但本研究中比較妊娠組和未妊娠組決定移植日的E2水平差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而是經(jīng)過分段分析后發(fā)現(xiàn)決定移植日的E2值處于366～＜732pmol／L這一水平時(shí)最有利于胚胎著床。月經(jīng)周期中隨著雌激素水平的上升內(nèi)膜不斷增長(zhǎng)、增生和修復(fù)，當(dāng)體內(nèi)雌激素水平過低是會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生不佳而影響胚胎著床。Ma等［8］認(rèn)為雌激素水平是決定子宮內(nèi)膜容受轉(zhuǎn)向不應(yīng)期的關(guān)鍵因素，過高的雌激素水平可能會(huì)加快移植窗的關(guān)閉。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢過度刺激中高雌激素水平會(huì)損傷子宮內(nèi)膜容受性［9］，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)處于高雌激素水平婦女的子宮內(nèi)膜基因表達(dá)的改變也會(huì)破壞移植窗［10］。另外，在本研究中妊娠組與非妊娠組決定移植日LH峰（包括自然LH峰和人為注射HCG造成人工LH峰）出現(xiàn)率也具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，妊娠組決定移植日的LH峰出現(xiàn)率高于未妊娠組。眾所周知LH峰是誘導(dǎo)卵母細(xì)胞最終成熟及排卵的重要因素，但是近年發(fā)現(xiàn)LH對(duì)子宮內(nèi)膜也具有調(diào)節(jié)作用；通過多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上都存在有LH受體的表達(dá)，在“種植窗”達(dá)到最高峰，認(rèn)為L(zhǎng)H是誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜著床局部發(fā)生顯著性變化的主要原因［11］。人類通過注射大劑量的HCG誘導(dǎo)排卵，16h后子宮動(dòng)脈阻力指數(shù)明顯下降，這些結(jié)果都說明LH很有可能不僅是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部細(xì)胞成熟和功能分化、胚胎活化與子宮內(nèi)膜接受態(tài)轉(zhuǎn)化同步的關(guān)鍵因素，還可增強(qiáng)子宮血管的生成、血管穿透能力。LH峰的出現(xiàn)都有助于胚胎著床和妊娠，然而有學(xué)者認(rèn)為過高LH峰對(duì)移植窗也存在消極影響，因?yàn)長(zhǎng)H受體在子宮內(nèi)膜表達(dá)［12］，但是 Griesinger等［13］研究發(fā)現(xiàn)妊娠率與LH峰的高低無關(guān)。

目前，ICSI對(duì)凍存胚胎的復(fù)蘇率和植入率是否有影響還存在爭(zhēng)議。Macas等［14］認(rèn)為凍存的ICSI合子的植入率比常規(guī)IVF組明顯降低，原因可能是相比在正常生理受精過程中，獲能的精子與透明帶接觸，發(fā)生頂體反應(yīng)，隨后精子穿越透明帶，精卵融合。而在ICSI中，卵母細(xì)胞的受精與生理過程不同，首先精子被直接注射到卵細(xì)胞內(nèi)，卵母細(xì)胞沒有暴露在已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子中，因此沒有頂體反應(yīng)中頂體酶的釋放為精子穿越卵母細(xì)胞外周結(jié)構(gòu)及透明帶開辟通道，并觸發(fā)精子質(zhì)膜的生理學(xué)改變使精子具有與卵細(xì)胞膜融合的能力及因卵母細(xì)胞發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)，皮質(zhì)顆粒的釋放使透明帶變硬，卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也有所改變。其次，卵母細(xì)胞膜的多聚不飽和脂肪酸也沒有被精液中的氧自由基超氧化，可能導(dǎo)致膜的脆性和流動(dòng)性的減低。另外，ICSI的操作過程可能損傷卵母細(xì)胞的微管微絲系統(tǒng)，從而改變卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和分子組成，最終影響受精卵子對(duì)冷凍保護(hù)劑的反應(yīng)。但是徐艷文等［15］研究發(fā)現(xiàn)ICSI組的植入率為11．5%，較常規(guī)IVF組（5．7%）高，認(rèn)為植入率的增高可能與ICSI組的不育原因主要是男性因素有關(guān)。本研究結(jié)果顯示兩組的妊娠率無顯著性差異（χ2＝1．505，P＞0．05）。

總之，激素替代周期凍胚移植中通過監(jiān)測(cè)決定移植日的LH峰的出現(xiàn)、E2水平及子宮內(nèi)膜的形態(tài)對(duì)于尋找最佳移植窗具有重大意義，當(dāng)E2水平處于366～＜732pmol／L且子宮內(nèi)膜處于A型時(shí)妊娠率最高，同時(shí)LH峰的出現(xiàn)也有利于胚胎的著床。本研究是一個(gè)回顧性研究并且例數(shù)有限以及未能檢測(cè)患者的內(nèi)膜血流指數(shù)，同時(shí)未能研究LH的具體值對(duì)妊娠的影響是本研究的不足之處。

［1］ Groenewoud ER，Cantineau AE，Kollen BJ，et al．What is the optimal means of preparing the endometrium in frozen-thawed embryo transfer cycles？A systematic review and metaanalysis［J］．Hum Reprod Update，2013，19：458-470．

［2］ Xiao Z，Zhou X，Xu W，et al．Natural cycle is superior to hormone replacement therapy cycle for vitrificated-preserved frozen-thawed embryo transfer［J］．Syst Biol Reprod Med，2012，58：107-112．

［3］ Fatemi HM，Kyrou D，Bourgain C，et al．Cryopreservedthawed human embryo transfer：spontaneous natural cycle is superior to human chorionic gonadotropin-induced natural cycle［J］．Fertil Steril，2010，94：2054-2058．

［4］ 黃荷鳳 主編 ．現(xiàn)代輔助生殖技術(shù) ［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社 ．2003：129．

［5］ 朱鵬云，林妍，劉蕓 ．激素替代方案應(yīng)用于子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)不良患者凍胚移植內(nèi)膜準(zhǔn)備 ［J］．中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6：120-124．

［6］ 王麗娜，喬杰，李蓉，等 ．應(yīng)用彩色多普勒能量圖檢測(cè)子宮內(nèi)膜血流評(píng)價(jià)IVF-ET結(jié)局 ［J］．中國微創(chuàng)外科雜志，2006，6：857-860．

［7］ 李巖，李紅芳，吳成平，等 ．凍融胚胎移植81個(gè)周期臨床分析［J］．中國婦幼保健，2008，23：4458-4459．

［8］ Ma WG，Song H，Das SK，et al．Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100：2963-2968．

［9］ Krikun G，Schatz F，Taylor R，et al．Endometrial endothelial cell steroid receptor expression and steroid effects on gene expression ［J］．J Clin Endocrinol Metab，2005，90：1812-1818．

［10］ Haouzi D，Assou S，Dechanet C，et al．Controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization alters endometrial receptivity in humans：protocol effects ［J］．Biol Reprod，2010，82：679-686．

［11］ 莊廣倫 主編 ．現(xiàn)代輔助生殖技術(shù) ［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社 ．2005：70．

［12］ de Ziegler D，Cornel C，Bergeron C，et al．Controlled preparation of the endometrium with exogenous estradiol and progesterone in women having functioning ovaries［J］．Fertil Steril，1991，56：851-855．

［13］ Griesinger G，Weig M，Schroer A，et al．Mid-cycle serum levels of endogenous LH are not associated with the likelihood of pregnancy in artificial frozen-thawed embryo transfer cycles without pituitary suppression ［J］．Hum Reprod，2007，22：2589-2593．

［14］ Macas E，Imthurn B，Borsos M，et al．Impairment of the developmental potential of frozen-thawed human zygotes obtained after intracytoplasmic sperm injection ［J］．Fertil Steril，1998，69：630-635．

［15］ 徐艷文，莊廣倫，方叢，等 ．卵胞漿內(nèi)單精子注射對(duì)胚胎冷凍保存的影響 ［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2002，37：36-37．