抗菌肽Maximin衍生物的體外殺精效果研究

張尉，侯麗，周越，辛玲，杜江，郭穎，高娜娜，賴仞，王慧萍＊，于和鳴＊

（1．北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京100730；2．國家人口計生委科學技術研究所，北京100081；3．中國科學院昆明動物研究所，昆明650223）

壬苯醇醚-9（Nonoxinol-9，N-9）因其具有強大的殺精效果成為廣泛接受的表面活性劑類殺精劑［1］，已經(jīng)在美國和其他一些國家使用超過了30年［2］。作為一種有效的殺精避孕陰道外用生物制劑，除了擁有快速有效的殺精避孕性質之外，安全低毒也非常重要。但近年來有研究表明，N-9存在安全隱患，長期反復使用可能會對子宮內(nèi)膜上皮細胞造成損傷［3－4］，所以盡快研制新型安全的殺精避孕劑已迫在眉睫?？咕模ˋntimicrobial peptides）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類抵抗外源性病原微生物致病作用的防御性小分子多肽（分子質量＜10ku），是宿主固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分［5］。每種抗菌肽都有其特定的抗菌譜，部分抗菌肽還兼具殺精子作用（如 Magainin）［6－7］。因此，抗菌肽成為近年來國內(nèi)外殺微生物劑研發(fā)的熱點。其中線性陽離子多肽Maximin是賴仞課題組最早從中國大蹼鈴蟾（Bombina maxima）皮膚中分離提取的具有自主知識產(chǎn)權的先導化合物［8］（專利號：ZL 00122415．8），該化合物具有廣譜抗菌、抗腫瘤細胞、抗HIV等特點，并與同濃度的國外Magainin具有相似的精子制動活性［9］，故成為本實驗殺精分析首選抗菌肽。為了優(yōu)化Maximin的殺精活性，在原有的結構基礎上，賴仞課題組對其結構進行了一系列改良。本文通過對19種抗菌肽Maximin衍生物（M1～M19）進行體外殺精和細胞毒性作用的評價，篩選出有望成為安全、有效的新型體外殺精劑的候選物。

材料與方法

一、研究對象

1．精液采集及分析：精液樣品來源于北京市人類精子庫（注冊登記號：006184110108171012）。選擇育齡、健康和有正常生育史的男性志愿者48例，年齡為25～35歲，取精前禁欲72h，手淫法獲取精液（精液量＞2ml），于37℃保溫液化30min。液化后進行常規(guī)分析，嚴格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版［10］推薦的標準執(zhí)行，其中精子總數(shù)60×106～100×106／ml，精液濃度＞20×106／ml，精子活動率＞60%。本實驗經(jīng)過國家人口計生委科學技術研究所生殖醫(yī)學倫理委員會批準，征得志愿者知情同意。

2．藥品：19種抗菌肽 Maximin衍生物（M1～M19）由吉爾生化（上海）有限公司合成，液相色譜（HPLC）分析進行純度鑒定，純度≥95%。用生理鹽水將Maximin衍生物配制成4×105mg／L的儲備液，4℃貯存，臨用前生理鹽水稀釋成相應濃度。

3．細胞株：人宮頸癌細胞株 Hela-229由山東省腫瘤防治研究院韓建軍副主任醫(yī)師惠贈，采用含10% 胎牛血清的DMEM（pH 7．4）完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

4．試劑：N-9（Igepal CO630，Sigma，美國）、DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國）、胎牛血清（GIBCO）、0．25% 胰 蛋 白 酶 （GIBCO）、PBS（Hyclone，美國）、CCK-8（日本同仁化學研究所）、伊紅－苯胺黑（深圳華康生物醫(yī)學工程有限公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

5．主要儀器：光學顯微鏡（LW100B，中國上海），血細胞分類計數(shù)器［XK06-9J，普賽德（北京）儀器設備有限公司］，凈工作臺（北京半導體設備一廠），CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），酶聯(lián)免疫檢測儀（Multiskan MK3，Thermo，美國）。

二、研究方法

1．體外殺精實驗：按照 WHO推薦的Sander-Cramer方法［11］，將工作濃度均為2 000mg／L 的Maximin衍生物（M1～M19）分別與精液以5∶1的比例混合，在盡可能短的時間內(nèi)用移液管反復吹打5次，使之充分混勻，37℃水浴孵育。藥物與精液混合后開始計時，20s后立即取20μl混合液置載玻片上，高倍顯微鏡（×400）下觀察計數(shù)。隨機觀察5個高倍鏡視野，若有活動精子，計數(shù)200個精子，活動率＝（活動精子數(shù)／精子總數(shù)）×100%。每組用3位供精者的精液，每份標本重復測2次，以生理鹽水作為陰性對照，臨用前測定生理鹽水的原始pH值。

2．測定精子存活率實驗：伊紅－苯胺黑染色技術用以觀察精子的存活率［10，12］。將混合液與等量的伊紅－苯胺黑染料充分混合，靜置30s，吸少許染液在載玻片上制成涂片，空氣中干燥后，油鏡下觀察計數(shù)，被染色的精子記為死精子，未被染色的精子記為活精子。

3．EC100的測定：瞬間殺精效果可以用EC100來表示，即20s能夠100%制動精子的最低濃度［13］。將初篩具有明顯殺精效果的抗菌肽分別配制成500、1 000、1 500和2 000mg／L四種濃度梯度的溶液，采用Sander-Cramer方法，作用時間20s，同上顯微鏡下計數(shù)活精子，每份標本重復測定3次，繪制出EC100曲線圖。

4．抗菌肽細胞毒性研究：本實驗采用CCK－8試劑盒檢測抗菌肽和 N-9對 Hela-229的細胞毒性［14］。將具有較強殺精作用的五種抗菌肽 M1、M7、M11、M15和M17用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋分別成125、250、500和1 000mg／L 4種濃度梯度。首先以125mg／L 24h的細胞毒性作為標準，初步觀察細胞毒性大小，然后對毒性較小的抗菌肽用以上四種濃度觀察毒性效果。

將指數(shù)生長期的Hela-229細胞經(jīng)PBS清洗、0．25%胰蛋白酶消化、離心后，用DMEM完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整濃度至1×105細胞／ml，接種于96孔板，每孔100μl，每個濃度組設5個平行孔，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；次日更換新鮮的含藥完全培養(yǎng)液100μl，同時以不含藥的培養(yǎng)液作為陰性對照，含N-9的培養(yǎng)液作為陽性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，快速加入10μl的CCK-8，并使之均勻分布于孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，在酶標儀上測定各孔的OD值，采用雙波長方法，測定波長為450nm，參比波長為650nm。按照如下公式計算細胞的存活率：細胞存活率（%Cell viability）＝［（AS－Ab）／（AC－Ab）］×100%，其中 AS為實驗孔平均值（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、毒性物質），AC為對照孔平均值（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有毒性物質），Ab為空白孔平均值（不含細胞和毒性物質的培養(yǎng)基、CCK-8）。

N-9用 DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋成1．25、2．5、5和10mg／L 4種濃度梯度作為實驗組，以不加N-9的培養(yǎng)基作為陰性對照組，測定N-9對Hela-229的24h細胞毒性和半數(shù)抑制量（I C50），同上酶標法檢測計算細胞存活率。

5．抗菌肽殺精作用的時間－濃度依賴性測定：將抗菌肽配制成1 000、500、250和125mg／L的實驗液，應用Sander-Cramer方法，分別測定20、40、60和120s時的精子活力，以生理鹽水作為陰性對照，N-9（100mg／L）作為陽性對照。測定完畢之后，繪制出抗菌肽的時間－濃度依賴性曲線。

三、統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17．0軟件進行分析，采用方差檢驗法對數(shù)據(jù)進行分析。

結 果

一、抗菌肽的體外殺精效果

利用Sander-Cramer方法對收集到的符合條件的精液進行20s殺精處理，結果顯示（表1），19種抗菌肽衍生物（M1～M19）中 M1、M7、M11、M15、M17在濃度為2，000mg／L時均能完全制動精子。陰性對照為生理鹽水（pH7．4）。用伊紅－苯胺黑染色觀察的精子存活率實驗，結果表明2，000mg／L時5種抗菌肽作用之后精子無一存活。

表1 Maximin衍生物（M1～M19）殺精作用初篩（n＝3）

二、EC100測定結果

將5種具有明顯殺精效果的抗菌肽 M1、M7、M11、M15和M17分別進行EC100的測定。結果顯示（圖1），五種抗菌肽的EC100分別是：M7＝M11＝2 000mg／L，M1＝M15＝M17＝1 500mg／L，說明M1、M15和 M17的瞬間殺精效果（20s）優(yōu)于 M7和M11。

三、N-9對Hela-229的細胞毒性分析結果

利用1．25、2．5、5和10mg／L 4種濃度梯度分析N-9對Hela-229的細胞毒性。結果如圖2所示，N-9表現(xiàn)出較強的細胞毒性作用，毒性隨濃度的增長而增大，并有顯著性差異（P＜0．05）。據(jù)此數(shù)據(jù)算得 N-9的半抑制率IC50＝3．01mg／L。

圖1 五種抗菌肽的EC100曲線圖

圖2 N-9對 Hela-229的細胞毒性作用（n＝5）

四、Maximin衍生物細胞毒性初篩

將5種具有明顯殺精效果的抗菌肽M1、M7、M11、M15和M17分別進行細胞毒性初篩，實驗結果如表2所示，5種抗菌肽在125mg／L時，對Hela－229細胞的24h毒性分別是M11＜M15＜M17＜M7＜M1。

表2 5種Maximin衍生物對Hela-229細胞毒性作用初篩［（n＝5），（±s）］

表2 5種Maximin衍生物對Hela-229細胞毒性作用初篩［（n＝5），（±s）］

藥物濃度125mg／L 細胞存活率（%）M1 8．27± 0．47 M7 13．58± 1．76 M11 102．84± 3．76 M15 94．41±10．48 M17 43．38± 5．74

五、M11、M15和M17對Hela-229的細胞毒性分析結果

經(jīng)過細胞毒性初篩分析，M11、M15和M17三種抗菌肽的細胞毒性較小。將三種抗菌肽配制125、250、500和1 000mg／L 4種濃度梯度，進一步分析其細胞毒性情況。結果顯示，M11的細胞毒性最小，M15和M17的細胞毒性相對較強，毒性隨濃度的增大而增大，并具有顯著性差異（P＜0．05）（圖3）。

圖3 M11、M15和M17對Hela-229的細胞毒性作用（n＝5）

六、抗菌肽M11殺精作用的時間－濃度依賴性測定

將具有較強殺精效果和低細胞毒性的抗菌肽M11與精液以不同濃度梯度（125，250，500和1 000 mg／L）在不同時間點（20、40、60和120s）下分析其殺精效果。結果表明M11的殺精效果具有時間依賴性和濃度依賴性（圖4）。

圖4 M11殺精作用的時間－濃度依賴性曲線

討 論

在近幾十年間，許多抗菌肽分子已經(jīng)從各種生物體中分離得到，已有部分抗菌肽應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)、生物醫(yī)藥業(yè)以及臨床治療等領域［15］，但有關抗菌肽殺精避孕方面的研究卻相對較少，國外也僅有為數(shù)不多的抗菌肽如 Magainin［7］、Dermasptins［16］等被報道。

本實驗通過對19種抗菌肽Maximin衍生物（M1～M19）在2 000mg／L濃度下進行殺精作用初選，結果顯示，M1、M7、M11、M15和 M17這5種衍生物具有較強的殺精效果。進一步EC100分析顯示，2 000mg／L時，M7和M11作用20s時均能完全制動精子，而M1、M15和M17在1 500mg／L時即可達到同樣的效果，說明M1、M15和M17的瞬間殺精效果強于M7和M11。

利用Hela-229細胞對初選出的5種具有較強殺精作用的抗菌肽做細胞毒性研究時發(fā)現(xiàn)，125mg／L細胞毒性大?。篗11＜M15＜M17＜M7＜M1。后續(xù)通過深入的濃度梯度毒性研究時發(fā)現(xiàn)，僅有M11表現(xiàn)出幾乎無細胞毒性的特點，其他4種抗菌肽分子都具有較明顯的細胞毒性。因此，我們認為，低毒且有較強殺精效果的M11可作為研制安全殺精避孕陰道外用生物制劑的候選物，為進一步體外實驗、動物在體研究提供了參考依據(jù)。

國際上常用的N-9雖然有強大的殺精作用效果（EC100＝100mg／L），但相對 于它的 IC50＝3．01mg／L而言，N-9的細胞毒性非常大，這也印證了相關文獻報道。而M11則表現(xiàn)出幾乎無細胞毒性的特點，安全性明顯高于N-9。本實驗僅分析了M11的體外殺精作用和對Hela-229的單一細胞毒性作用，尚不全面，在以后的工作中還將對M11對紅細胞細胞毒性、殺精機制、抗陰道常見病菌作用等方面進行分析，同時開展動物體內(nèi)實驗，以期獲得更為全面的數(shù)據(jù)。

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