分泌型卷曲相關蛋白家族成員在多囊卵巢患者不同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中的基因表達

劉姝含，黃鑫，郝翠芳＊

（1．山東省青島大學醫(yī)學院，青島266000；2．山東省煙臺毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，煙臺264000）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡期婦女常見的一種內分泌及代謝異常所致的疾病，主要以慢性無排卵和高雄激素血癥為特征［1］。PCOS主要臨床表現(xiàn)有閉經、月經稀發(fā)或不規(guī)則子宮出血、不孕、多毛和（或）痤瘡［2］。文獻報道，育齡期婦女發(fā)病率約為10%～15%，占不育患者的30%～40%，其中有20%的患者需要輔助生殖技術進行助孕［3］。有資料表明，PCOS患者卵母細胞受精能力的下降，主要是由于其卵泡發(fā)育中斷所造成內部分子缺陷。普遍認為，卵泡的發(fā)生發(fā)育是一個復雜的過程，卵泡的生長發(fā)育與全身內分泌系統(tǒng)及卵巢內旁分泌密不可分［4］。在這一微環(huán)境中，通過卵丘與卵母細胞之間的雙向信號傳遞，卵母細胞逐漸獲得了發(fā)育的感受性，使其有能力進行減數(shù)分裂、受精、胚胎發(fā)育及后續(xù)的生長［5］。PCOS患者體內常存在高雄激素血癥、高胰島素血癥等多種內分泌紊亂，使卵母細胞的自我調節(jié)能力被打亂，從而導致了卵泡發(fā)育的微環(huán)境的改變，引起卵泡周圍血供異常，卵周顆粒細胞功能異常，因此在體外受精－胚胎移植（IVF-ET）過程中，PCOS患者雖然能夠獲取較多的卵母細胞，但是其受精率及胚胎發(fā)育潛能均不理想，胚胎著床率和妊娠率也隨之降低［6］。在促性腺激素（Gn）的作用下，顆粒細胞增殖、分化，通過旁分泌和縫隙連接控制著卵母細胞的生長和成熟。同時，卵丘－卵母細胞復合體（COCs）的成熟度也影響著卵丘顆粒細胞上的基因表達。

分泌型卷曲相關蛋白（secreted frizzled-related protein，sFRP）家族在結構上大約由300多個氨基酸組成，其中含有一個半胱氨酸富含區(qū)（CRD）結構域，該區(qū)域含有10個高度保守的半胱氨酸，與卷曲蛋白的胞外CRD區(qū)域有30%～40%的同源性，由于sFRPs具有與卷曲相關蛋白相似的CRD，所以可通過與之競爭性結合Wnt的方式拮抗Wnt信號［7］。sFRPs基因的表達被認為能有效地抑制Wnt信號通路的異常激活。在動物模型證實生殖過程中有Wnt信號通路組成元件的參與。Wnt信號通路參與調控卵泡發(fā)育與胚胎形成，同時，它在動物胚胎分化、胚胎軸向發(fā)育、細胞極性決定、生長和發(fā)育信息的傳遞以及成體組織動態(tài)平衡的維持中具有關鍵的調控作用［8］。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)了該家族5種不同類型的成員：sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5［9］。有學者報道，在嚙齒類動物sFRP2、sFRP4、sFRP5在 COCs中有表達，sFRP4和sFRP5在卵巢顆粒細胞中有明顯表達［10］。Maman等［11］研究證實，sFRP4和sFRP5在正常人卵丘顆粒細胞中有表達，且表達量均與卵泡成熟度呈負相關。Rattner等［12］于1997年鑒定哺乳動物基因跨膜受體卷曲蛋白家族時發(fā)現(xiàn)sFRP4，它包含1個富含CRD配體結合域的同源序列，并通過與Wnt信號通路的卷曲蛋白受體競爭性結合，抑制Wnt信號通路的傳導，作為其信號通路的抑制因子。近年來sFRP4亦得到了國內外學者的廣泛關注。業(yè)已證實，sFRP4基因在PCOS患者卵丘顆粒細胞上有表達，并且其表達量與卵泡成熟度呈負相關。因此，本實驗擬在PCOS及非PCOS患者不同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中，對sFRPs家族的5個成員（sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5）進行了基因表達分析，從而為揭示sFRPs家族成員在卵母細胞成熟及PCOS致病過程中的作用提供分子學依據。

材料與方法

一、研究對象

本實驗經青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院倫理委員會討論通過后開展。并與患者簽署知情同意書。PCOS診斷依據美國生殖醫(yī)學學會（ASRM）和歐洲人類生殖與胚胎學會（ESHRE）鹿特丹工作組修正的標準確定，即符合以下3項標準中的2項：（1）稀發(fā)排卵和（或）無排卵；（2）有高雄激素血癥的臨床表現(xiàn)（如多毛、痤瘡）或生化改變；（3）超聲發(fā)現(xiàn)多囊性卵巢：卵巢增大，或每側可以見到10～12個以上的直徑2～8mm的囊狀卵泡，或卵巢體積＞10mm。且排除其他引起高雄激素血癥的疾病（如先天性腎上腺皮質增生、分泌雄激素的腫瘤和庫欣綜合征等）后，診斷為PCOS。非PCOS組（non-PCOS）均因女方輸卵管因素行IVF-ET，納入標準為月經周期正常，超聲檢查無多囊卵巢的改變，基礎內分泌正常。PCOS患者及non-PCOS患者均無男方因素。PCOS患者與non-PCOS患者的臨床特點比較列于表1。

表1 PCOS與非PCOS患者的臨床特點（±s）

表1 PCOS與非PCOS患者的臨床特點（±s）

注：與non-PCOS組比較，＊P＜0．05；BMI：體重指數(shù)，F(xiàn)SH：卵泡刺激素，LH：黃體生成素，T：睪酮

組 別 例數(shù) COCs 年齡（歲） 體重指數(shù)（BMI）（kg／m2） FSH（U／L） LH （U／L）PCOS 11 98 31．8±2．1 25．9±2．7 5．2±1．3 8．6±3．8＊non-PCOS 16 100 31．4±2．4 24．6±3．7 5．7±1．5 4．5±2．1組 別 例數(shù) T（nmol／L） FSH起始量（U） FSH總用量（U） 獲卵數(shù)（枚） 受精率（%）PCOS 11 0．38±0．14＊182．9±23．9 1 651．2±561．1 17．1±3．9 73．3±13．3 non-PCOS 16 0．25±0．15 203．9±33．5 1 771．9±320．3 14．9±4．2 66．6±21．7

二、研究方法

1．促排卵方案：入選的所有患者均采用達菲林／果納芬（FSH）標準長方案促排卵治療。黃體中期降調節(jié)，行促性腺激素釋放激動劑（GnRH-a）（達菲林，Ipsen，法國）0．05mg／d皮下注射。當垂體充分降 調 節(jié)，LH ＜3．0U／L、雌 二 醇 （E2）＜109．8pmol／L時，行 FSH（果納芬，Merck-Serono，德國）150～250U／d皮下注射。B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當2個以上卵泡直徑≥18mm且每個主導卵泡分泌的E2＞1 098pmol／L時，肌注250μg人絨毛膜促性腺激素（HCG）（艾澤，Merck-Serono，德國），36h后經陰道B超引導下穿刺取卵，獲得COCs。

2．顆粒細胞的收集：穿刺取卵后，采用機械法剝除單個卵母細胞周圍的部分卵丘顆粒細胞，在PBS緩沖液中沖洗3次后，立即溶解于80μl RLT緩沖液（RNeasy Mini Kit，Qiagen，德國）中（來源于單個卵母細胞周圍的顆粒細胞單獨保存于1個eppendorf管中），裂解后的顆粒細胞置于－80℃冷凍保存。本實驗共獲得198個卵丘顆粒細胞樣本。根據卵母細胞成熟度不同，將其周圍的卵丘顆粒細胞分為4組：non-PCOS患者成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞組（CCN－MII），non-PCOS患者非成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞（CCN－MI＋GV），PCOS患者成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞組（CCP－MII）和PCOS患者非成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞（CCP－MI＋GV）。

3．RNA的提取和逆轉錄反應：根據相同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞混合后，參照RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，并進行RNA電泳和分光光度計分別測定A260和A280的吸光度，從而進行RNA質量的鑒定，逆轉錄反應依照實時熒光定量試劑盒（Prime Script RT Reagent Kit）（大連寶生物）說明書進行。

4．實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）：均參照SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量試劑盒（大連寶生物）說明書進行qRT-PCR反應，使用Rotor Gene 3000型實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（Corbett Research，澳大利亞）測定。各基因特異性引物序列見表2，其中GAPDH基因為內參基因。循環(huán)參數(shù)：95℃30s，95℃5s40個循環(huán)，60℃20s。每次反應結束均進行一次熔解曲線分析，并計算出各基因與GAPDH的相對關系。每次qRT-PCR反應均重復3次，每個基因表達情況的倍數(shù)變化通過DDCt方法［13］進行分析。

三、統(tǒng)計學分析

表2 qRT-PCR引物序列

結 果

一、sFRPs在PCOS患者的顆粒細胞中的表達

在PCOS患者不同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中，即 CCP－MⅡ與 CCP－MⅠ＋GV相比，sFRP4在兩組中的表達變化有顯著性差異（P＜0．05）。sFRP1、sFRP2、sFRP3在兩組顆粒細胞中的基因表達無顯著性差異（P＞0．05）（表3）。而sFRP5在PCOS患者兩組顆粒細胞中的表達變化雖有檢測到差異［（1．62±0．36），P＜0．05］但由于qRT-PCR單次實驗誤差相對較大，普遍認為至少大于2．0倍以上才算有區(qū)別，為避免爭議，暫忽略該基因在兩組中的表達變化差異。

二、sFRPs在non-PCOS患者的顆粒細胞中的表達

在non-PCOS患者不同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中，sFRPs家族成員中檢測到sFRP4和sFRP5的表達有變化，即 CCN－MⅡ與 CCN-MⅠ＋GV比較中sFRP4和sFRP5的表達變化均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），而sFRP1、sFRP2和sFRP3在non-PCOS患者中表達無顯著變化（表4）。

表3 在CCP－MⅡ與CCP－MⅠ＋GV中sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5的相對表達量［（±s），（n＝3）］

表3 在CCP－MⅡ與CCP－MⅠ＋GV中sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5的相對表達量［（±s），（n＝3）］

注：與CCP－MⅡ組比較，＊P＜0．05

sFRP1 sFRP2 sFRP3 sFRP4 sFRP5 CCP－MⅠ＋GV 1．55±0．97 2．02±1．01 1．27±0．96 7．80±1．21＊ 1．62±0．36組 別＊CCP－MⅡ 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00

表4 在CCN－MⅡ與CCN－MⅠ＋GV中sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5的相對表達量［（±s），（n＝3）］

表4 在CCN－MⅡ與CCN－MⅠ＋GV中sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5的相對表達量［（±s），（n＝3）］

注：與CCN－MⅡ 組比較，＊P＜0．05

sFRP1 sFRP2 sFRP3 sFRP4 sFRP5 CCN－MⅠ＋GV 1．30±0．07 2．08±1．68 2．02±1．50 7．04±1．30＊ 2．84±0．73組 別＊CCN－MⅡ 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00

三、sFRP4在PCOS患者和non-PCOS患者卵母細胞成熟過程中的表達

由于sFRP4在PCOS患者和non-PCOS患者卵母細胞成熟過程中均有變化，因此，我們對兩組相同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中sFRP4的表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)其在PCOS及non-PCOS患者間的表達無顯著性差異［MII組（1．49±1．80）vs．（1．00±0．00）（P＝0．43）；MI＋GV 組（1．00±0．55）vs．（1．00±0．00）（P＝0．95）］。

討 論

一、卵丘顆粒細胞上sFRP4的表達量隨卵母細胞的成熟而逐漸降低

Wnt通路參與了卵母細胞與胚胎發(fā)育過程，sFRP4作為Wnt信號通路的抑制因子，通過抑制Wnt通路參與生殖過程。而且，Wnt通路與卵母細胞成熟相關。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，在顆粒細胞中，有兩種Wnt分子存在：Wnt2和Wnt4。在嚙齒類動物，Wnt2持續(xù)存在于卵泡發(fā)育成熟的全過程中。還有報道，sFRP4在COCs和顆粒細胞中均有表達［10］，且sFRP4在卵巢中的轉錄位點集中于Fz1、Wnt4和 Fz4［15］。本觀察顯示，無論是PCOS還是non-PCOS患者的卵丘顆粒細胞中，sFRP4在顆粒細胞中的表達量均與卵母細胞成熟度呈負相關，即其在MI和GV卵母細胞時顆粒細胞中的表達量顯著高于其在MII卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達量，表明卵母細胞的成熟與sFRP4的表達量下降有關。另外，已有學者對sFRP4基因在正常人卵母細胞成熟過程中以及在PCOS患者卵母細胞成熟過程中的表達進行了研究［11，16］，本實驗結果與上述兩文獻中報道的研究結果一致，即sFRP4基因在正常人及PCOS患者卵母細胞成熟過程中表達均逐漸減少。值得注意的是，我們對sFRP4基因在PCOS患者與non-PCOS患者相同成熟度卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中的表達進行了觀察，發(fā)現(xiàn)兩組間無顯著性差異。提示該基因的表達主要參與了卵母細胞成熟的過程，而與PCOS患者的致病機制關系也許不大。而且，Haouzi等［17］曾對PCOS患者及non-PCOS患者MII卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞進行研究，篩選到相關的差異表達基因，其中并不包括sFRP家族中任何基因。本實驗結果也與此結論一致。推測sFRP4基因在卵母細胞發(fā)育成熟過程中發(fā)揮作用，而與PCOS疾病發(fā)生無關。

二、sFRP5僅與non-PCOS患者的卵母細胞成熟有關

本研究顯示，在non-PCOS患者，sFRP5在 MI和GV卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達量顯著高于在MII卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達量，此結果與Maman等［11］報道結果相一致。而在PCOS患者，sFRP5在不同成熟度卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達無顯著性差異。故推測，sFRP5只參與了正常人的卵母細胞成熟過程，而PCOS患者的卵母細胞發(fā)育成熟過程中sFRP5的作用可能不明顯，或許PCOS患者與non-PCOS患者的卵母細胞成熟過程中存在不同的信號通路。目前已知，卵泡發(fā)育存在很多復雜的信號轉導通路，包括：PI3K-Akt通路［18］、MAPK 通路［19］、TGF-beta通路［20］、KL／Kit通路［21］、Wnt通路和 RTK-Ras通路。

三、sFRP1、sFRP2和sFRP3在調控卵母細胞成熟過程中的作用不大

盡管有文獻報道sFRP2在卵巢顆粒細胞中有表達［10］，但也有學者認為其在卵丘顆粒細胞中的表達量太低，所以無法對其進行精確地量化［11］。sFRP2的表達也需要Wnt4，并且可以潛在地抑制Wnt4的作用［22］。然而，sFRP2主要參與成骨細胞和神經元細胞的細胞分化［22］，而sFRP4參與顆粒細胞的終末分化［23］，因此sFRP2并不像sFRP4那樣在卵母細胞發(fā)育成熟過程中發(fā)揮重要作用。

有研究［24］報道，sFRP1在嚙齒類動物卵泡發(fā)育中有表達，并且在黃體期達高峰，且sFRP1在卵巢血管生成過程中也有表達。另外，已證實sFRP3主要參與肉芽組織的形成和心肌修復，而且sFRP3主要通過Wnt8而發(fā)揮抑制Wnt通路的作用。本研究表明，sFRP1、sFRP2和sFRP3在調控卵母細胞成熟過程中的作用不大。

綜上所述，雖然sFRPs家族成員具有類似的化學結構，但其功能卻不盡相同。在PCOS患者中，sFRP4在卵丘顆粒細胞上的表達量隨卵母細胞成熟而降低，而在 non-PCOS 患者中，sFRP4 和sFRP5均參與調控卵母細胞成熟的調控過程。而sFRP1、sFRP2和sFRP3在調控卵母細胞成熟過程中的作用不大。

［1］ Carmina E，Lobo RA．Polycystic ovary syndrome（PCOS）：arguably the most common endocrinopathy is associated with significant morbidity in women［J］．J Clin Endocrinol Metab，1999，84：1897-1899．

［2］ Franks S．Polycystic ovary syndrome ［J］．N Engl J Med，1995，333：853-861．

［3］ Siristatidis CS，Vrachnis N，Creatsa M，et al．In vitro maturation in subfertile women with polycystic ovarian syndrome undergoing assisted reproduction［CD］．Cochrane Database Syst Rev，2013，21：CD006606．

［4］ Dumesic DA，Padmanabhan V，Abbott DH．Polycystic ovary syndrome and oocyte developmental competence［J］．Obstet Gynecol Surv，2008，63：39-48．

［5］ Jabara S，Coutifaris C．In vitro fertilization in the PCOS patient：clinical considerations［J］．Semin Reprod Med，2003，21：317-324．

［6］ Franks S，Roberts R，Hardy K．Gonadotrophin regimens and oocyte quality in women with polycystic ovaries［J／OL］．Reprod Biomed Online，2003，6：181-184．

［7］ Soriano ME，Scorrano L．Traveling Bax and forth from mitochondria to control apoptosis［J］．Cell，2011，145：15-17．

［8］ Reya T，Clevers H．Wnt signalling in stem cells and cancer［J］．Nature，2005，434：843-850．

［9］ Sercan Z，Pehlivan M，Sercan HO．Expression profile of WNT，F(xiàn)ZD and sFRP genes in human hematopoietic cells［J］．Leuk Res，2010，34：946-949．

［10］ Hernandez-Gonzalez I，Gonzalez-Robayna I，Shimada M，et al．Gene expression profiles of cumulus cell oocyte complexes during ovulation reveal cumulus cells express neuronal and immune-related genes：does this expand their role in the ovulation process？［J］．Mol Endocrinol，2006，20：1300-1321．

［11］ Maman E，Yung Y，Cohen B，et al．Expression and regulation of sFRP family members in human granulosa cells［J］．Mol Hum Reprod，2011，17：399-404．

［12］ Rattner A1，Hsieh JC，Smallwood PM，et al．A family of secreted proteins contains homology to the cysteine-rich ligand-binding domain of frizzled receptors ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：2859-2863．

［13］ Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］．Methods，2001，25：402-408．

［14］ Philibert P，Biason-Lauber A，Rouzier R，et al．Identification and functional analysis of a new WNT4gene mutation among 28adolescent girls with primary amenorrhea and müllerian duct abnormalities：a French collaborative study ［J］．J Clin Endocrinol Metab，2008，93：895-900．

［15］ Hsieh M，Johnson MA，Greenberg NM，et al．Regulated expression of Wnts and Frizzleds at specific stages of follicular development in the rodent ovary ［J］．Endocrinology，2002，143：898-908．

［16］ Huang X，Hao C，Shen X，et al．Differences in the transcriptional profiles of human cumulus cells isolated from MI and MII oocytes of patients with polycystic ovary syndrome［J］．Reproduction，2013，145：597-608．

［17］ Haouzi D，Assou S，Monzo C，et al．Altered gene expression profile in cumulus cells of mature MII oocytes from patients with polycystic ovary syndrome［J］．Hum Reprod，2012，27：3523-3530．

［18］ Liu K，Rajareddy S，Liu L，et al．Control of mammalian oocyte growth and early follicular development by the oocyte PI3 kinase pathway：new roles for an old timer［J］．Dev Biol，2006，299：1-11．

［19］ Harrouk W，Clarke HJ．Mitogen-activated protein（MAP）kinase during the acquisition of meiotic competence by growing oocytes of the mouse［J］．Mol Reprod Dev，1995，41：29-36．

［20］ Elvin JA，Yan C，Matzuk MM．Growth differentiation factor-9 stimulates progesterone synthesis in granulosa cells via a prostaglandin E2／EP2receptor pathway［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：10288-10293．

［21］ Driancourt MA，Reynaud K，Cortvrindt R，et al．Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function［J］．Rev Reprod，2000，5：143-152．

［22］ Brophy PD，Lang KM，Dressler GR．The secreted frizzled related protein 2（SFRP2）gene is a target of the Pax2transcription factor［J］．J Biol Chem，2003，278：52401-52405．

［23］ Vaes BL，Dechering KJ，van Someren EP，et al．Microarray analysis reveals expression regulation of Wnt antagonists in differentiating osteoblasts［J］．Bone，2005，36：803-811．

［24］ Dufourcq P，Couffinhal T，Ezan J，et al．FrzA，a secreted frizzled related protein，induced angiogenic response ［J］．Circulation，2002，106：3097-3103．