運動通過調控CREB促進成年神經(jīng)發(fā)生

張憲亮 徐波 鄧玉強，2 賀強 錢帥偉

1青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室 華東師范大學 （上海 200241）

2南通大學體育科學學院

3煙臺大學體育學院

成年神經(jīng)發(fā)生（adult neurogenesis）是指成年后，哺乳動物某些腦區(qū)還能夠生成新的內源性神經(jīng)干細胞，并轉化成功能性神經(jīng)元加入到現(xiàn)有的神經(jīng)網(wǎng)絡回路中，最終整合到成年腦的結構和功能中的過程，其主要分布在側腦室的室管膜下區(qū) （the subventricular zone of the lateral ventricle，SVZ） 和海馬齒狀回的顆粒下層（the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus，SGZ）。 SVZ產生3型祖細胞（成神經(jīng)細胞），并沿著遷移流遷移到嗅覺中樞，整合到嗅覺回路；而SGZ產生顆粒細胞，并在神經(jīng)回路中進行功能性整合，形成新的突觸聯(lián)系，與學習記憶密切相關[1]。正常生理條件下，神經(jīng)發(fā)生處于一個相對平衡狀態(tài)，以維持神經(jīng)元功能穩(wěn)定以及腦功能健康。但運動、衰老、豐富環(huán)境和應激等因素會引起神經(jīng)發(fā)生的改變[2]。一般來說，適宜的運動可促進成年海馬齒狀回SGZ神經(jīng)干細胞的增殖、存活和分化，提高學習記憶能力，維持腦健康[3]。那么，運動是如何影響成年大腦神經(jīng)發(fā)生過程呢？其生物學機制又如何呢？

動物實驗發(fā)現(xiàn)，新生神經(jīng)元的產生受到細胞間相互作用和某些信號通路的影響。不管是通過降低神經(jīng)發(fā)生速率使神經(jīng)元產生過少，還是通過抑制細胞凋亡使神經(jīng)元產生過多，都會損害海馬學習記憶能力。因此，成年海馬的神經(jīng)發(fā)生必須受到精確調控[4]。機體通過哪一信號通路整合各種刺激，精確調控神經(jīng)發(fā)生以滿足機體的需求仍不清楚。但新生神經(jīng)元的存活以及形態(tài)的成熟都涉及到cAMP反應元件結合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB）。據(jù)此，本文將運動、CREB以及神經(jīng)發(fā)生的研究進展進行綜述。

1 CREB與神經(jīng)發(fā)生

CREB是真核細胞內核轉錄增強因子，受多種因素激活，進而調控靶基因轉錄。它是由一段30bp左右的DNA片段構成的cAMP應答序列，這段序列含有高度保守的5’-TGACGTCA-3’的8堿基回文結構，主要存在于基因的啟動子與增強子上。CREB信號通路的關鍵環(huán)節(jié)是CREB磷酸化。免疫組化實驗證實，CREB信號通路在神經(jīng)發(fā)生中的作用主要由磷酸化的CREB（pCREB）調控。海馬SGZ區(qū)產生的絕大多數(shù)新生未成熟神經(jīng)元都伴隨有CREB磷酸化[5，6]。 Jagasia等[6]發(fā)現(xiàn)，成年海馬齒狀回新生顆粒細胞從產生后的3～21天一直伴有CREB磷酸化，且pCREB的免疫活性伴隨著DCX（doublecortin+，主要用于標記未成熟的新生神經(jīng)細胞）的表達，隨著顆粒細胞的成熟，DCX的表達減少，pCREB也隨之下調。

目前，通過各種方法已經(jīng)檢測到CREB信號通路在成年動物腦內神經(jīng)發(fā)生中的作用。磷酸二酯酶-4（phosphodiesterase 4，PDE-4）抑制劑激活了成年腦內的CREB信號通路，促進齒狀回神經(jīng)干細胞增殖，新生神經(jīng)元存活以及樹突分支[7]。 Giachino等[8]在敲除了CREB的轉基因鼠中發(fā)現(xiàn)新生顆粒細胞減少，說明CREB信號在成年新生神經(jīng)元的存活中起了關鍵作用。以上研究說明CREB信號通路可調節(jié)成年神經(jīng)發(fā)生，然而CREB信號通路是直接調控干細胞還是通過其它分子機制起作用，目前仍不清楚。

2 運動與神經(jīng)發(fā)生

成年海馬神經(jīng)發(fā)生受到外源性和內源性因素的共同調控。1997年，Kempermann等[9]首先發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境可促進成年海馬神經(jīng)發(fā)生，同時提高了海馬依賴的空間學習記憶能力。豐富環(huán)境包含運動、社會交往、學習訓練及身體活動等多個因素。為了確定具體哪個因素在成年海馬神經(jīng)發(fā)生中具有關鍵作用，van Praag等[10]把各個因素剝離出來，將小鼠分為運動、學習、豐富環(huán)境及對照組，發(fā)現(xiàn)只有運動組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞增殖及存活能力增強、空間記憶能力提高。Ehninger等[11]將小鼠分為豐富環(huán)境組及不含跑輪的豐富環(huán)境組，發(fā)現(xiàn)運動對神經(jīng)發(fā)生具有更明顯的促進作用。Kobilo等[12]驗證了Ehninger的研究，將C57BL/6雌性小鼠分為對照組、跑輪組、豐富環(huán)境組及不含跑輪的豐富環(huán)境組，發(fā)現(xiàn)運動在促進海馬神經(jīng)發(fā)生及增加BDNF表達上起了關鍵作用。

運動可促進成年腦內神經(jīng)發(fā)生。一些研究發(fā)現(xiàn)，不管是被動運動還是主動運動均可促進成年海馬神經(jīng)發(fā)生。Kim等[13]研究了1周強制性跑臺訓練對SD大鼠（5周齡）神經(jīng)發(fā)生的影響。結果表明，中、低強度訓練均可顯著增加大鼠海馬齒狀回5-溴-2-脫氧尿苷陽性（BrdU+）細胞的數(shù)量。Lou等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，低、中強度跑臺訓練能促進大鼠（5周齡）海馬神經(jīng)發(fā)生和相關基因表達。Synder等[15]探討了自主運動對6周齡小鼠新生神經(jīng)細胞存活和功能性整合的作用，結果發(fā)現(xiàn)12天自主運動增加了海馬齒狀回SGZ區(qū)新生細胞數(shù)量，提示自主運動促進了新生神經(jīng)細胞的功能性整合。Mustroph等[16]將C57BL/6雄性小鼠分為對照組、跑輪運動組、豐富環(huán)境組和豐富環(huán)境+跑輪組。32天后進行Morris水迷宮實驗，并采用BrdU+/NeuN+雙標記新生神經(jīng)元。結果顯示，跑輪組和豐富環(huán)境+跑輪組BrdU+/NeuN+的陽性細胞顯著增加，學習記憶能力顯著提高，提示跑輪運動促進了大腦神經(jīng)發(fā)生，提高學習記憶能力。以上實驗表明，被動運動與主動運動均能誘導成年海馬神經(jīng)發(fā)生，且適宜的運動不僅在數(shù)量上，還在質量上影響神經(jīng)發(fā)生。

運動也可抑制由年齡增加引起的神經(jīng)發(fā)生水平下降[17，18]。Lafenêtre等[18]發(fā)現(xiàn)，運動抑制了由年齡增加引起的海馬神經(jīng)細胞增殖的減少，增加新生顆粒細胞的產生，老年小鼠神經(jīng)發(fā)生水平明顯低于成年小鼠。最近研究發(fā)現(xiàn)，運動還可促進AD模型鼠的神經(jīng)發(fā)生，提高認知功能[19，20]。跑輪運動減少了AD轉基因鼠（過表達APP695swe）的Aβ沉積，改善其空間記憶能力[19]。Rodriguez等[20]發(fā)現(xiàn)，AD轉基因鼠神經(jīng)發(fā)生水平下降，但是運動后神經(jīng)發(fā)生水平得以提高。因此，運動不僅可促進成年鼠神經(jīng)發(fā)生，還可抑制由年齡增加或AD等因素造成的神經(jīng)發(fā)生水平的降低。

3 CREB在運動依賴的神經(jīng)發(fā)生中的作用

適宜的運動不僅可以促進海馬齒狀回SGZ神經(jīng)發(fā)生，還可影響新生神經(jīng)元的成熟過程。Luo等[21]在小鼠腦缺血造模后令其進行自主跑輪運動，結果發(fā)現(xiàn)運動可促進腦缺血小鼠海馬齒狀回新生顆粒細胞的產生，同時CREB磷酸化水平上調，改善了腦缺血造成的學習記憶能力下降。Thakker等[22]發(fā)現(xiàn)運動調節(jié)了CREB的磷酸化水平，促進新生神經(jīng)元的產生及存活。Huang等[23]發(fā)現(xiàn)自主跑輪運動后，成年海馬齒狀回新生神經(jīng)元細胞存活能力增強，同時伴隨著齒狀回內CREB磷酸化水平升高。因此，運動依賴的神經(jīng)發(fā)生伴隨著CREB的磷酸化。CREB作為一種細胞核內轉錄因子，可通過自身磷酸化修飾調節(jié)下游靶基因的轉錄。CREB能整合Ca2+、cAMP及生長因子等信號，是細胞內多條信號轉導通路的集聚點。Ca2+、cAMP及生長因子等可誘導CREB的磷酸化，磷酸化的CREB與cAMP反應元件 （cAMP response element，CRE）結合，與輔助激活因子CREB結合蛋白（CREB-binding protein，CBP）及p300（一種基因編碼的核蛋白）一起在共激活因子作用下，調控下游靶基因的轉錄。同時，CRE序列中CpG的甲基化可抑制其與CREB結合；miRNA也可改變RNA結合蛋白的位置，按順序結合CBP/p300，抑制CBP/p300活性；DNA甲基化及miRNA都可以直接作用于CREB轉錄后的目的基因表達，共同調控成年神經(jīng)發(fā)生（圖1）。

3.1 運動通過pCREB調節(jié)神經(jīng)發(fā)生

圖1 CREB各階段與神經(jīng)發(fā)生

Suijo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，14天自主運動后小鼠海馬內腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、CREB上調，mTOR及p70S6K磷酸化水平提高，并且海馬神經(jīng)發(fā)生能力增強。Lee等[25]研究發(fā)現(xiàn)自主運動提高了大鼠海馬內BDNF、CREB、p-CREB的蛋白水平。運動通過CREB的磷酸化調節(jié)成年海馬神經(jīng)發(fā)生，同時伴隨著BDNF蛋白水平升高，說明運動調節(jié)神經(jīng)發(fā)生的機制可能與CREB的磷酸化及BDNF蛋白表達有關。海馬內BDNF的快速增加會短暫激活TrkB導致CREB的磷酸化，而BDNF的漸進性增強會持續(xù)性激活TrkB受體并使CREB持續(xù)性磷酸化[26]。急性和漸進性增加BDNF對CREB磷酸化產生了不同的結果，說明CREB的磷酸化可能是由BDNF的改變引起的。BDNF蛋白高表達會激活絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPK），從而促進CREB在133位點磷酸化[27]。同時，運動可顯著提高BDNF水平。因此，運動可能提高了BDNF表達水平，通過TrkB受體，作用于MAPK途徑，促使CREB在133位點磷酸化，促進海馬神經(jīng)發(fā)生。此外，與神經(jīng)發(fā)生相關的生長因子還包括VEGF、IGF-1等，運動促進神經(jīng)發(fā)生的同時伴隨著VEGF[28]、IGF-1[29]表達增加。

Ma等[30]發(fā)現(xiàn)運動后5-HT1A受體、CREB的表達上調。運動首先激活了海馬5-HT系統(tǒng)，促進5-HT合成和5-HT1A受體表達增加，神經(jīng)傳遞功能增強。由于5-HT1A受體是G蛋白偶聯(lián)受體 （G-proteincoupled receptors，GPCRs），通過G 蛋白偶聯(lián)使cAMP環(huán)化酶活性升高，接著cAMP水平升高，進而激活PKA，后者在133位點磷酸化CREB，促使下游靶基因轉錄。同時，5-HT、去甲腎上腺素、多巴胺等神經(jīng)遞質通過GPCRs介導的信號通路調節(jié)成年神經(jīng)發(fā)生[31]。因此，運動后5-HT、多巴胺等神經(jīng)遞質通過GPCRs，促使腺苷酸環(huán)化酶 （adenylate cyclase，AC）生成cAMP，cAMP激活PKA，轉移到核內使CREB磷酸化，調控神經(jīng)發(fā)生。

在成年海馬齒狀回新生顆粒細胞內發(fā)現(xiàn)了NMDA受體的激活[32]，而敲除NMDA受體的成神經(jīng)細胞出現(xiàn)死亡[33]。這提示，NMDA受體與神經(jīng)發(fā)生密切相關。Lou等[14]發(fā)現(xiàn)運動促進神經(jīng)發(fā)生，并提高了海馬NMDAR1 mRNA水平。 Real等[34]將大鼠分為3天、7天、15天、30天運動組及對照組，免疫組化檢測AMPA受體亞基GluR1、GluR2/3的變化，發(fā)現(xiàn)30天運動后GluR1、GluR2/3表達增加，運動誘導腦的可塑性增強。NMDA受體、AMPA受體激活后，胞內Ca2+增加，激活了鈣調激酶 （CaMK），CaMKIV是CREB在133位點磷酸化的關鍵環(huán)節(jié)，而CaMKⅡ可使CREB在142/143位點磷酸化。同時，Ca2+還可通過第二信使cAMP促使CREB在133位點磷酸化。因此，運動誘導神經(jīng)發(fā)生的機制可能是運動上調了NMDAR、AMPAR的表達。同時，適宜的運動可使谷氨酸在正常范圍內升高，與其受體結合，促使Ca2+通道打開，Ca2+濃度增加，激活CaMK或cAMP，調節(jié)CREB的磷酸化，調控神經(jīng)發(fā)生。豐富性環(huán)境小鼠海馬神經(jīng)祖細胞增殖的同時，其海馬組織中CaMK和CREB的表達量也顯著增加，證實了CaMK/CREB表達增加可能在豐富環(huán)境介導的神經(jīng)發(fā)生中起重要作用。

以上研究表明，運動可通過CREB上游分子（如BDNF等營養(yǎng)因子介導的MAPK途徑、5-HT介導的cAMP/PKA/CREB信號通路、Ca2+介導的Ca2+/CaMK通路）促進CREB磷酸化，調控神經(jīng)發(fā)生（圖2）。

圖2 運動對CREB磷酸化水平的調控

3.2 運動通過共激活因子調節(jié)神經(jīng)發(fā)生

CREB的轉錄水平依賴于CBP/p300等的募集。CBP/p300是一種組蛋白乙?；D移酶，可促進核小體上組蛋白乙酰化，使染色體結構松散，從而更有利于轉錄因子、RNA聚合酶與DNA的結合。CREB磷酸化后，必須與CRE結合，在CBP/p300的共同作用下才能發(fā)揮作用。影響CRE位點及CBP/p300募集的共激活因子包括CREB活性調節(jié)傳導子 （transducers of regulated CREB activity ，TORC）、TOX3、神經(jīng)細胞特異性轉錄因子4（LIM domain only4，LMO4）、下游監(jiān)管元素拮抗劑調制器（Downstream regulatory element antagonist modulator，DREAM）和鈣反應激活因子（Calcium responsive transactivator，CREST）、 血清效應因子（serum response factor，SRF）等。 運動可能通過影響這些共激活因子調控神經(jīng)發(fā)生。

TORC1在成年腦內神經(jīng)發(fā)生及突觸可塑性中起重要作用。磷酸化的TORC1沒有轉錄活性，Ca2+和cAMP可調節(jié)TORC1去磷酸化，從而調節(jié)海馬神經(jīng)元發(fā)生[35]。Ca2+水平增加，激活了鈣調磷酸酶的活性，后者可使磷酸化的TORC1去磷酸化，從而激活CREB的轉錄。運動上調了谷氨酸水平，增加胞內Ca2+濃度，且運動激活GPCR，使cAMP表達增加[30]。因此，運動后Ca2+濃度及cAMP增加，介導TORC1的去磷酸化，TORC1去磷酸化后被轉運至核內，結合CREB，促進CBP/p300的募集，作用于靶基因，引起腦內神經(jīng)發(fā)生。

運動后NDMA、AMPA受體激活以及谷氨酸水平上升均能引起Ca2+內流[14，34]。 目前在Ca2+介導的CREB信號通路中發(fā)現(xiàn)了許多轉錄因子。TOX3是一種快速移動的盒蛋白，在CREB與CBP結合后起作用，激活神經(jīng)元內相關基因的轉錄。敲除TOX3的小鼠神經(jīng)元內，CREB介導的c-fos活性降低。并且TOX3的轉錄與CRE位點密切相關。有學者提出TOX3可能通過結合小溝和彎曲DNA，使CREB與CBP結合物靠近轉錄位點，從而促進轉錄[36]。LMO4在齒狀回及嗅覺系統(tǒng)等成年腦內的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達，可調節(jié)軸突發(fā)育以及控制丘腦皮層模式和神經(jīng)元密度[37]。Ca2+的流動激活了MAPK和CaMKIV，上調LMO4，促進神經(jīng)元轉錄；同時LMO4也可被PKA通路激活。DREAM和CREST抑制CREB的轉錄。DREAM和CREB結合后抑制CBP的募集，Ca2+內流時，DRE釋放出DREAM，抑制作用消除。總之，DREAM蛋白的減少促使CREB介導的基因轉錄增加，抵制神經(jīng)元降解。CREST結合CREB后抑制皮質及海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育[38]。因此，運動引起Ca2+內流，上調了TOX3、LMO4，下調了DREAM、CREST，促進CBP的募集，激活神經(jīng)元內相關基因的轉錄，調節(jié)神經(jīng)發(fā)生。

SRF在海馬齒狀回顆粒細胞發(fā)生以及早期未成熟神經(jīng)元遷移中起重要作用[39]。生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及神經(jīng)元的活性可通過MAPKs、鈣調激酶、Rho/肌動蛋白等信號通路，激活SRF或SRF輔助因子（包括MRTF、TCF），促使SRF與CREB結合，調節(jié)下游c-fos基因[40]。同時，大量實驗已證實運動可上調BDNF、VEGF、IGF-1的表達[24，28，29]，因此，運動還可能通過生長因子、營養(yǎng)因子等調節(jié)SRF，促進未成熟神經(jīng)元遷移，神經(jīng)顆粒細胞存活。

3.3 運動通過表觀遺傳修飾調節(jié)神經(jīng)發(fā)生

表觀遺傳修飾可影響基因轉錄活性，但并不引起基因序列改變，包括DNA甲基化、miRNA的調控等。DNA甲基化和miRNA可調節(jié)CREB信號通路。CRE序列中含有CpG結構，可被DNA甲基化，CpG的甲基化可抑制其與CREB結合[41]。神經(jīng)元活性可調節(jié)DNA甲基化，說明新生神經(jīng)元可通過調節(jié)DNA的甲基化來激活CREB目的基因。CREB可與甲基CpG結合蛋白2 （methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2）相互作用。MeCP2與甲基化的CpGs結合，募集抑制因子，改變染色體結構。然而有研究顯示，MeCP2也可募集輔助因子，激活CREB特殊目的基因的轉錄[42]。MeCP2活性受到絲氨酸殘基磷酸化以及去磷酸化的影響。神經(jīng)元活性以及Ca2+的內流會激活CaMKII介導的MeCP2在Ser421的磷酸化，促進樹突的形成和棘突的成熟[43]。BDNF是CREB的目的基因之一，有效的運動訓練可降低BDNF基因啟動子區(qū)域甲基化水平，加強BDNF基因轉錄，從而提高海馬BDNF mRNA水平[44]。BDNF對于神經(jīng)發(fā)生的促進效應已經(jīng)得到證實。因此，運動可能通過降低DNA甲基化水平改善CREB目的基因BDNF的表達來影響神經(jīng)發(fā)生。

miRNA是一類約有19～23個核苷酸大小的mRNA，主要通過RNA降解或翻譯抑制來抑制mRNA的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA（miR-132，miR-134等）在成年神經(jīng)發(fā)生中調控干細胞存活、分化。CREB可通過miR-132和MeCP2調節(jié)神經(jīng)元形態(tài)[45]，而miR-134也可調節(jié)CREB轉錄后基因表達[46]。運動可通過調節(jié)肌肉特異性miRNA來調節(jié)肌細胞增殖分化，調控肌細胞發(fā)育。那么，運動是否通過miRNA調控神經(jīng)發(fā)生呢？研究發(fā)現(xiàn)，BDNF通過TrkB/mTOR通路抑制miR-134促進Limk1的合成。敲除miR-134的大鼠海馬神經(jīng)元棘突的長度及寬度增加[47]。而且抑制miR-134會誘導CREB的活性[46]，因此，運動可能通過BDNF抑制miR-134，增強CREB活性，調節(jié)神經(jīng)發(fā)生。

4 小結與展望

運動不僅可促進成年鼠海馬神經(jīng)發(fā)生，還可抑制由年齡增加、AD等導致的神經(jīng)發(fā)生的下降。并且成年海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生一直伴隨著CREB的磷酸化，說明運動可能通過CREB調控成年海馬神經(jīng)發(fā)生。 CREB磷酸化受到cAMP/PKA、Ca2+/CaMK、MAPK等通路調節(jié)，多種共激活因子（TORC、TOX3、LMO-4、SRF）可促進pCREB募集更多的CBP/p300，提高CREB基因轉錄水平，DNA甲基化、miRNA可直接作用于CREB靶基因，影響其表達。因此，運動對CREB的調控涉及到CREB磷酸化的調控、共激活因子對CREB轉錄水平的調控及CREB目的基因的調控。而運動通過哪一階段調控CREB，從而調節(jié)神經(jīng)發(fā)生，目前并不明確?，F(xiàn)有的研究僅集中于運動影響CREB上游的BDNF等分子來調節(jié)神經(jīng)發(fā)生。運動是否可通過某個信號轉導通路來影響CREB的磷酸化從而調節(jié)神經(jīng)發(fā)生，是否可通過營養(yǎng)因子、Ca2+等影響CREB相關的共激活因子來調節(jié)CREB的轉錄，是否可影響DNA甲基化或某些miRNA來影響CREB目的基因的轉錄，從而調節(jié)神經(jīng)發(fā)生，這些問題在今后的研究中仍需進一步探索。

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