自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦出血患者血清S100β、GFAP的影響

王萬宏，王亞林，盧慶韜

自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦出血患者血清S100β、GFAP的影響

王萬宏1，王亞林1，盧慶韜2

（1.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063300；2.唐山市工人醫(yī)院分院外科）

非創(chuàng)傷性腦出血最常見的原因為高血壓性腦出血。長期的高血壓導致腦動脈粥樣硬化，腦動脈粥樣斑塊形成。當遇誘發(fā)因素存在時，血壓驟然升高，從而導致腦出血發(fā)生。大多數(shù)腦出血患者都有腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損。促進受損腦組織修復是當前腦出血治療的主要任務(wù)。以往研究表明，自體骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）移植能改善神經(jīng)功能缺損程度并提高日常生活活動能力［1，2］，但對腦出血患者腦組織損傷血清標志物的影響尚未見報道。本研究觀察自體MSCs移植對腦出血患者血清S100β、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的影響，為腦出血的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2010年1月－2013年7月我院收治的腦出血患者60例為研究對象，均行鉆孔引流術(shù)，術(shù)后1周行自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植30例為觀察組，行常規(guī)治療30例為對照組。觀察組：男18例，女12例；年齡40.5－68.0歲，平均年齡（54.0±6.5）歲；CT定位出血均為基底核區(qū)；出血量：20－30ml 10例，30－50ml 13例，＞50ml 7例；患肢肌力0級9例，Ⅰ－Ⅱ級12例，Ⅲ－Ⅳ級9例。對照組：男19例，女11例；年齡41.0－67.5歲，平均年齡（54.3±6.2）歲；CT定位出血均為基底核區(qū)；出血量：20－30ml 9例，30－50ml 13例，＞50ml 8例；患肢肌力0級10例，Ⅰ－Ⅱ級11例，Ⅲ－Ⅳ級9例。兩組患者性別、年齡、出血部位、出血量、患肢肌力等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2納入及排除標準

納入標準：①年齡＜80歲，發(fā)病后有失語、偏癱、運動障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀；②有鉆孔引流手術(shù)指征；③取得患者家屬的知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①年齡≥80歲，有嚴重過敏史的過敏體質(zhì)者；②合并心、肝、腎等其他臟器嚴重功能障礙者；③凝血機制障礙者；④對MSCs移植治療期望過高，有不切實際要求者。

1.3骨髓采集

患者進手術(shù)室于局部麻醉下行骨髓穿刺術(shù)，以髂后上棘為穿刺點，30號骨髓穿刺針進行穿刺，20 ml干燥無菌注射器于兩側(cè)髂后上棘共抽取120－180 ml骨髓，注入細胞培養(yǎng)液中，迅速送至無菌細胞培養(yǎng)室。骨髓穿刺術(shù)后將患者送入ICU重癥監(jiān)護室，注意監(jiān)測生命體征［3］。

1.4MSCs的分離和培養(yǎng)

MSCs分離：無菌采集抗凝骨髓120－180ml；消毒采血袋壁及輸液管，將試劑A液、B液均加至骨髓液中，靜置40min；吸取上層液體轉(zhuǎn)移至離心管，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心10min；棄上清，將適量C液加入各離心管中，吹打混勻細胞制成細胞懸液，離心10min；用吸管將細胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入適量A液，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心5min；棄上清，以1 800rpm離心5min；吸取少量細胞懸液，滴于細胞計數(shù)板，顯微鏡下觀察計數(shù)。MSCs培養(yǎng)：調(diào)整細胞密度為1.0×107／ml接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱；培養(yǎng)至第4d，去除未貼壁的懸浮死細胞，換完全細胞培養(yǎng)液；每3d換液1次，待細胞生長融合達瓶底面積的80－90%時，加入含0.25%胰蛋白酶的消化液2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱消化約1min，取出培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察，見細胞收縮成類圓形的細胞，加入中和胰蛋白酶3ml于培養(yǎng)液中，以防過度消化。把溶液倒入離心管中，加入完全培養(yǎng)液反復吹打，吸棄氣泡，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清，反復吹打后，加入完全培養(yǎng)液5ml，調(diào)整細胞數(shù)為5×105／ml，移到細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5－7d。按1∶2比例傳代，2－3d換液一次，期間觀察待細胞基本融合后，用0.25%胰蛋白酶5ml溶解，往培養(yǎng)液中加入完全培養(yǎng)液，吹打制備單細胞懸液［4］。

1.5 MSCs的移植

患者躺于平板床上，取左側(cè)臥位，屈髖屈膝，頭盡量曲向前胸，背部與床面垂直；穿刺點選擇3－4腰椎棘突間隙。常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾，以2%利多卡因3ml行局部浸潤麻醉，麻醉至椎間韌帶，以9號穿刺針以垂直背部方向自穿刺點刺入約5cm左右，待針尖抵抗感消失，緩慢拔出針芯。無色透明的腦脊液流出表示穿刺成功，將MSCs細胞懸液5ml緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，穿入針芯，拔出穿刺針，無菌紗布覆蓋，膠布固定，囑患者去枕平臥6h。

1.6血清S100β、GFAP檢測方法

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清S100β、GFAP，試劑盒均購自北京尚柏生物工程公司，嚴格按試劑盒說明進行操作。具體步驟：自密封袋中取出ELISA板并標記；分別加入10μl標準品、10μl血清于板孔中，輕輕混勻，每孔加入200μl抗體，混勻30s，37℃溫育30min；洗滌反應(yīng)板5次，每孔加入100μl HRP，混勻10s，37℃溫育30min；洗滌反應(yīng)板5次，每孔加入200μl TNB顯色液，混勻后室溫溫育20min；每孔加入100μl終止液，輕輕混勻30s，30min內(nèi)在450nm處讀OD值；制標準曲線，確定血清樣品S100β、GFAP濃度。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0軟件包進行統(tǒng)計，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差（x—±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1自體MSCs移植對腦出血患者血清S100β的影響對照組和觀察組患者血清S100β蛋白含量在干預1d、4d、7d均呈遞減趨勢（P＜0.05）；干預前及干預后1d觀察組患者血清S100β蛋白與對照組差異無統(tǒng)計學意義，干預后4d、7d值均低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 自體MSCs移植對腦出血患者血清S100β的影響（x—±s，n＝30）

2.2自體MSCs移植對腦出血患者血清GFAP的影響兩組干預后1d、4d、7d血清GFAP呈時間依賴性降低（P＜0.05）；觀察組干預后4d、7d血清GFAP值均低于對照組，見表2。

3 討論

腦出血發(fā)病率較高，占急性腦血管疾病的20%－ 30%，其中高血壓性腦出血是非創(chuàng)傷性腦出血的最常見原因。研究表明，在腦出血早期階段，某些血清生化標志物可用來判斷神經(jīng)功能損害程度及范圍，甚至優(yōu)于CT及MRI等影像學檢查［5］。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最廣的細胞，不僅能支持、營養(yǎng)神經(jīng)元，而且參與宿主防御及組織修復。GFAP為星形膠質(zhì)細胞中的主要的中間絲蛋白［6］。S100β蛋白存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星型細胞、少突膠質(zhì)細胞中。當中樞神經(jīng)受損時，S100β和GFAP溢出并通過血腦屏障進入血液。兩者參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的病理變化，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期病情監(jiān)測的血清標志物。

表2 自體MSCs移植對腦出血患者血清GFAP的影響（x—±s，n＝30）

MSCs來源于中胚層，是一種多潛能干細胞，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或創(chuàng)傷修復具有一定作用。李計成［7］等對20例腦出血患者實施自體MSCs移植，發(fā)現(xiàn)移植后6個月患者神經(jīng)功能缺損程度評定（NIHSS評分）和日常生活活動能力評定（Barthel指數(shù)）均明顯提高，且具有安全性。朱建新［8］對32例腦出血患者進行自體MSCs移植治療，證實其對腦出血患者安全可行，近期療效確定。本研究進一步觀察自體MSCs移植對腦出血患者血清S100β、GFAP的影響，結(jié)果顯示：①觀察組在腦出血1周接受自體MSCs移植后1d、4d、7d血清S100β蛋白依次降低，每一時間點S100β蛋白均低于對照組水平；②兩組干預后1d、4d、7d血清GFAP呈時間依賴性降低；觀察組干預后1d、4d、7d血清GFAP值均低于對照組。研究結(jié)果在分子水平證實，自體MSCs移植能減少血清神經(jīng)細胞損傷標志物S100β、GFAP的水平，間接表明MSCs移植存活后，可多向分化為神經(jīng)細胞，發(fā)揮促進神經(jīng)組織修復、神經(jīng)功能恢復的作用。

綜上所述，MSCs不僅取材方便，無免疫原性，而且體外擴增迅速、可自體移植。能通過降低腦出血患者血清S100β、GFAP水平，促進腦出血患者神經(jīng)細胞損傷的修復。

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2014－01－14）

1007－4287（2014）12－2011－03