白藜蘆醇對(duì)同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO、eNOS和小凹蛋白表達(dá)影響

張 麗，李 林，李愛(ài)歆，高 山＊

白藜蘆醇對(duì)同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO、eNOS和小凹蛋白表達(dá)影響

張 麗1，李 林2，李愛(ài)歆1，高 山1＊

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和功能的異常是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO具有擴(kuò)張血管的作用，同時(shí)，通過(guò)抑制血小板的聚集、白細(xì)胞的粘附、減少氧自由基的產(chǎn)生等起到抗AS作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。當(dāng)細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激時(shí)，eNOS與小凹蛋白（CAV1）分離，eNOS被激活，從而產(chǎn)生NO。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇（Res）具有潛在的抗AS作用，但其作用機(jī)制尚不明確。CAV1是PI3k／Akt上游靶點(diǎn)［1］，是調(diào)節(jié)eNOS的負(fù)性因子，因此，我們推測(cè)Res可通過(guò)抑制CAV1的表達(dá)，從而上調(diào)eNOS的表達(dá)。

本研究通過(guò)同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）模型，觀察不同濃度下的Res對(duì)CAV1和NO系統(tǒng)的變化。

1 材料與方法

1.1主要試劑臍帶、DMEM培養(yǎng)基、MTT、兔抗人CAV1多克隆抗體、兔抗人eNOS多克隆抗體、Trizol、TaKaRa RNA PCR試劑盒、硝酸還原酶法試劑盒、western blotting試劑盒等。

1.2主要儀器96孔培養(yǎng)板、PCR儀、紫外分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、紫外光譜分析儀、熒光分光光度計(jì)等。

1.3HUVEC的培養(yǎng)取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康孕婦，正常分娩胎兒的新鮮臍帶，采用膠原酶消化分離內(nèi)皮細(xì)胞，接種細(xì)胞于含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)胞傳2－3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.4Hcy損傷模型的構(gòu)造及細(xì)胞活力的檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞消化計(jì)數(shù)接種于96孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)到次融合狀態(tài)（80%）時(shí)，用M－199無(wú)血清培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。用0、0.1、0.25、0.5、1mmol／L濃度的Hcy處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，每孔加入20μl的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl，震蕩15分鐘，在490 nm波長(zhǎng)下，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀每孔的吸光度值。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞液的收集重復(fù)上述步驟至用M－199無(wú)血清培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液后，加入0、0.1、0.5、1、10μmol／L濃度的Res，除空白對(duì)照組外，其余各組均加入1mmol／L濃度的Hcy，培養(yǎng)24 h。

1.6NO濃度的檢測(cè)將不同組別的細(xì)胞培養(yǎng)液按照硝酸還原酶法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定NO濃度。

1.7eNOS和CAV1蛋白的測(cè)定根據(jù)western blotting試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行eNOS和CAV1蛋白的測(cè)定，蛋白條帶采用Image Lab軟件自動(dòng)分析。

1.8eNOS和CAV1mRNA的測(cè)定不同組別的細(xì)胞培按照TaKaRa RNA PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄cDNA。取2μl的cDNA進(jìn)行Real－time PCR，反應(yīng)體系為25μl。eNOS上游引物為5′－ACCCTAGAATGGAGAGCAT－3′，下游引物5′－GCCTGCACTGTCTGTGCCA－3′。CAV1上游引物為5′－CCTCTACAAGCTCAACAACATG－3′，下游引物為5′－CACATCTTCAGAGTCAATCTGG－3′，內(nèi)參β－actin上游引物為5′－AGCGACACAGTGCTGGAC－3′，下游引物為5′－ACAAGCAATGATCTTGATGAC－3′。

1.9統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，探討NO系統(tǒng)和CAV1的相關(guān)性，采用Pearson線性相關(guān)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hcy損傷HUVEC適宜濃度的確定96孔板內(nèi)加入0、0.1、0.25、0.5、1mmol／L的Hcy，培養(yǎng)24、48h后，通過(guò)MTT法測(cè)定HUVEC增殖活性。培養(yǎng)24和48h，隨著Hcy濃度的增加，HUVEC增殖活性可劑量依賴性地降低（P＜0.01）。同時(shí)48h的Hcy損傷組的細(xì)胞增殖活性低于24h各組（P＜0.01）。故本次實(shí)驗(yàn)采用1mmol／L的Hcy作為損傷HUVEC模型的濃度，同時(shí)培養(yǎng)時(shí)間定為24h（表1）。

表1 不同濃度的Hcy對(duì)HUVEC增殖活性（OD490nm）的影響（x—±s）

2.2 不同組別NO濃度比較 Hcy損傷組的NO含量低于空白對(duì)照組；加入Res后，NO含量逐漸上升，0.1和1μmol／L的Res組的NO含量升高幅度最大。加入不同濃度的Res各組的NO含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 Res對(duì)Hcy致HUVEC損傷的NO濃度的影響（x—±s）

2.3不同組別eNOS和CAV1蛋白的比較Hcy損傷組的eNOS蛋白含量低于空白對(duì)照組；加入不同濃度的Res后，eNOS蛋白含量升高，0.1μmol／L組升高幅度最大。Res各組的eNOS蛋白含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01）。

Hcy損傷組的CAV1蛋白含量高于空白對(duì)照組；Res濃度為1μmol／L時(shí)，CAV1蛋白含量降低的幅度最大。加入Res各組的CAV1蛋白含量均低于Hcy損傷組（P＜0.01）。（見(jiàn)表3，圖1）。

表3 Res對(duì)Hcy致HUVEC損傷的eNOS蛋白和CAV1蛋白的影響（x—±s）

圖1 Res對(duì)Hcy致HUVEC損傷的eNOS蛋白和CAV1蛋白的影響

2.4不同組別eNOS和CAV1 mRNA的比較Hcy損傷組的eNOS mRNA含量顯著下降；加入0.1μmol／L Res后，eNOS的mRNA含量升高幅度最大。加入Res各組的eNOS的mRNA含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01）。

Hcy損傷組的CAV 1的mRNA含量高于空白對(duì)照組；Res濃度為1μmol／L時(shí)，CAV 1的mRNA降低的幅度最大。加入Res各組的CAV 1mRNA含量均低于Hcy損傷組（P＜0.01）。（見(jiàn)表4，圖2）

表4 Res對(duì)Hcy致HUVEC損傷的eNOS和CAV1 mRNA的影響（x—±s）

2.5NO系統(tǒng)與CAV1的相關(guān)性NO與CAV1蛋白及CAV1的mRNA呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；eNOS蛋白與CAV1蛋白具呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）；eNOS的mRNA表達(dá)量與CAV1的mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。（見(jiàn)表5）

圖2 Res對(duì)Hcy致HUVEC損傷的eNOS和CAV1 mRNA的影響

表5 Res組內(nèi)NO、eNOS和CAV1蛋白及mRNA的相關(guān)性分析

3 討論

抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂已成為防治AS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。內(nèi)皮細(xì)胞合成的NO產(chǎn)生的異?？蓪?dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，同時(shí)NO濃度的下降不僅使血管舒張異常，而且其抗血小板聚集、抗平滑肌增殖作用減弱，可加速AS的進(jìn)程。Drab M等［2］通過(guò)敲除小鼠CAV1基因后，證明CAV1可抑制eNOS的活性。CAV1與eNOS結(jié)合后，通過(guò)Rac1／Akt信號(hào)通道抑制eNOS的活性，減少NO的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致AS。Res具有潛在的抗AS作用?？赏ㄟ^(guò)增加超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽及其還原酶等細(xì)胞保護(hù)因子，增強(qiáng)機(jī)體抗氧自由基防御系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)高膽固醇血癥家兔模型的研究，RSV通過(guò)抑制ox－LDL的形成，抑制血小板的聚集和平滑肌增殖。Res可以通過(guò)減少脂質(zhì)堆積、抗氧化和抗炎癥因子等作用抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，從而減緩AS的進(jìn)程。

Hcy隨著劑量和時(shí)間的增加，HUVEC增殖活性逐漸降低。郝寶順等［3］研究證實(shí)Hcy對(duì)HUVEC增殖活性的影響具有劑量依賴性。故本研究選擇1mmol／L的Hcy，培養(yǎng)24h建立HUVEC氧化應(yīng)激損傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討。國(guó)內(nèi)張海洋［4］等研究表明，Hcy損傷模型組的NO濃度、eNOS的mRNA含量及蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組，這與我們的研究結(jié)果一致。我們的研究發(fā)現(xiàn)，加入不同濃度的Res后，能逆轉(zhuǎn)Hcy對(duì)HUVEC的損傷。不同濃度下的Res組，NO濃度、eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)含量具有劑量依賴關(guān)系。當(dāng)Res濃度為0.1μmol／L時(shí)，NO濃度、eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)含量升高的幅度最大。當(dāng)Res的濃度達(dá)到10 μmol／L時(shí)，NO含量、eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)量升高幅度減少。Res濃度在0.01－1μmol／L范圍時(shí)，CAV1的mRNA和蛋白含量隨著表達(dá)逐漸下降，當(dāng)Res濃度為1μmol／L時(shí)，CAV1的mRNA和蛋白表達(dá)含量下降幅度最大，但當(dāng)Res濃度為10 μmol／L時(shí)，CAV1的mRNA和蛋白表達(dá)含量卻出現(xiàn)上升趨勢(shì)。在Res組中進(jìn)行NO系統(tǒng)與CAV1的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，NO、eNOS與CAV1具有負(fù)相關(guān)。

Thomas WP等［5］研究表明，Res能上調(diào)HUVEC中eNOS的mRNA的水平，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度增加，eNOS的mRNA水平也增加。Takizawa Y等［6］采用1μmol／L濃度的Res連續(xù)6天作用于HUVEC中，證實(shí)eNOS的表達(dá)水平上調(diào)。

我們的研究結(jié)果表明，Res抗AS的作用，其機(jī)制與抑制CAV1的mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)eNOS表達(dá)，促進(jìn)NO的釋放有關(guān)。

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2014－05－17）

1007－4287（2014）12－1923－03

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（D201210）

＊通訊作者