乳桿菌H D 1.7肽類代謝產(chǎn)物的分離檢測

陳兵，原韜，黃微薇，王艷梅

（1.黑龍江工業(yè)學院環(huán)境工程系，黑龍江雞西158100；2.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001；3.黑龍江省科學院高技術研究所，黑龍江哈爾濱150001）

乳酸菌是一類將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化成乳酸的厭氧菌。日常生活中，人們經(jīng)常腌制酸菜這種發(fā)酵性食品，主要就是依靠乳酸菌厭氧發(fā)酵的原理。在發(fā)酵基質(zhì)酸菜水中含有多種乳酸菌的代謝產(chǎn)物，主要為肽類、多糖等。其中肽類物質(zhì)經(jīng)證實與Nisin[1]類似，具有一定的抑菌活性。

本課題研究結(jié)合梯度鹽析[2-3]的方法，通過減壓濃縮[4]、透析層析的技術手段從乳酸桿菌HD1.7[5]的酸菜水[6]中提純了這種肽類物質(zhì)[7]，并深入研究其抑菌能力，與Nisin進行對照，同時檢測出其確切分子量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

測試菌：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，江蘇綠科生物技術有限公司；酸菜水，雞西豐源食品有限公司L-乳酸酸菜發(fā)酵液；胰蛋白酶 [0.15%（g/mL）]：美國GIBCO 公司；Marker（2 ku～36 ku）：紐英倫（NEB）生物技術有限公司；Nisin（1×106IU/g）：美國 Sigma公司。

測試菌培養(yǎng)基：準確稱取酵母膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂10 g，加水至 1 000 mL，調(diào)節(jié) pH6.8～7.0。

圖1 酸菜發(fā)酵液中肽類代謝產(chǎn)物的提取工藝Fig.1 Extraction technology of peptide metabolites from sauerkraut fermentation juice

ELITE 300垂直板電泳儀：美國WEALTEC公司；YC-3000噴霧冷凍干燥機：上海雅程儀器設備有限公司；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司。

1.2 工藝流程

1.3 實驗設計

1.3.1 發(fā)酵液濃縮條件選擇

量取300 mL酸菜發(fā)酵液，在室溫下用離心機3 000 r/min～4 000 r/min離心處理30 min，棄除下層雜質(zhì)和菌體泥狀混合物，保留上層清液，測量記錄上清液體積。然后用抽真空水浴式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在系列溫度梯度下抽真空減壓式濃縮1 h，得到相應條件濃縮液。

溫度梯度：25、30、35、40、45、50、55 ℃。

將上述溫度梯度濃縮所得的濃縮液，分別稀釋至濃縮前上清液體積值，進行濾紙片抑菌試驗[8-9]，同時和濃縮前上清液進行對比，測定抑菌圈直徑。

以濃縮液黏稠性、抑菌能力為評價標準，選擇最佳濃縮條件。

1.3.2 濃縮液鹽析條件選擇

向上述抑菌效果較好的酸菜濃縮液中加入一定濃度的（NH4）2SO4溶液并攪拌，注意沉淀量的大小。首先選取質(zhì)量濃度較低的（NH4）2SO4溶液進行鹽析[10]，觀察有無沉淀出現(xiàn)，逐漸增大（NH4）2SO4溶液質(zhì)量濃度，觀察沉淀有無。

若有沉淀出現(xiàn)，將該濃度的（NH4）2SO4鹽析后的溶液攪拌均勻，分裝離心管進行離心，溫度4℃，轉(zhuǎn)速20 000 r/min，離心處理20 min。離心后取出離心管，以上清液和沉淀為測試物，用同濃度（NH4）2SO4做空白進行抑菌試驗，觀察抑菌圈大小。

混合上述離心管中的上清液，繼續(xù)增大（NH4）2SO4溶液質(zhì)量濃度進行鹽析，當沉淀再次出現(xiàn)時，按照上述離心操作并進行抑菌試驗。

依此類推，直至不再出現(xiàn)沉淀為止。

鹽析濃度梯度：15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%。

以鹽析沉淀量多少、抑菌效果為評價標準，選擇最佳鹽析條件。

1.3.3 透析除硫酸銨鹽條件

已知Nisin的分子量為3 510 u，以透析袋的截留分子量乘以2＜目的蛋白分子量的原則為標準選擇透析袋進行透析除鹽[11]。收集梯度鹽析沉淀，加入0.01 mol/L Tris-H3PO4直至沉淀完全溶解，裝入透析袋截留分子量為1 500 u的透析袋在4℃下透析18 h～24 h，透析外液使用蒸餾水，5 h～6 h更換一次透析外液，直至向外液中滴入BaCl2溶液，不生成BaSO4為止。保留透析袋內(nèi)物質(zhì)進行層析分離試驗。

1.3.4 透析物分離純化

將100 g Sephadex G-25干膠顆粒懸浮于3倍量的蒸餾水中充分溶脹，進行凝膠活化[12]?；罨煤笱bSephadex G-25柱。采用HAc-NaAc緩沖溶液平衡層析柱，平衡后上樣分離，流速控制為1.0 mL/min，上樣量為5 mL，層析緩沖液使用pH=3.6的HAc-NaAc溶液30 mL，用0.02 mol/LKCl溶液90 mL作為洗脫液進行洗脫[12]。按1 mL/管定時接收，并數(shù)字標記層析接收管，試驗共標記96個接收管，在紫外280nm下進行吸光度值測定[13]。根據(jù)層析接收物質(zhì)吸光值的不同，繪制層析接收液吸光值曲線，選擇吸光值較高部分進行收集。

1.3.5 分離純化液干燥條件

混合A280值較大的層析管內(nèi)溶液，采用YC-3000噴霧冷凍干燥機在-15℃下進行噴霧干燥[14]，制備干粉樣品。

1.3.6 干粉性質(zhì)測定

干粉對比Nisin進行抑菌能力測定。稱取10 mg干粉和10 mg Nisin，分別用0.01 mol/LTris-H3PO4溶解，并用蒸餾水稀釋至1 mg/mL。用0.01 mol/L Tris-H3PO4做空白進行濾紙片抑菌試驗，對比抑菌圈大小。

干粉具備蛋白質(zhì)性質(zhì)檢測。將10mg干粉用0.01mol/L Tris-H3PO4溶解，并用蒸餾水稀釋至1 mg/mL，用0.5%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加入1.5 mg/mL胰蛋白酶消化，并保溫1 h后，沸水浴3 min使胰蛋白酶滅活，然后進行抑菌試驗，用pH調(diào)至中性的干粉溶解液做空白。

干粉分子量大小測定。采用聚丙烯酰胺垂直板電泳[15]分析干粉的分子量大小，電泳點樣測試物為Nisin，干粉樣品3份（干粉1、2、3）及Marker。電泳后用蒸餾水沖洗膠片，將膠片浸入考馬斯亮藍R-250染色液，染色2 h～3 h，再用蒸餾水沖洗膠片，然后浸入脫色液脫色1次～2次，每次30 min。觀察脫色膠片上各譜帶位置，參照Marker確定樣品分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液最佳濃縮條件確定

原始300 mL酸菜發(fā)酵液離心處理后的上清液體積為248 mL。將發(fā)酵液溫度梯度濃縮，得到相應條件的濃縮液七種，樣品性狀見表1。

表1 不同溫度下濃縮液狀態(tài)比較Table 1 The comparison of oncentrated liquid state in different temperature

將25℃條件下的濃縮液稀釋后的樣品編號為1，30℃條件下的濃縮液稀釋后的樣品編號為2，以此類推，得到不同溫度下的濃縮液稀釋后的抑菌效果見表2。

表2 稀釋液抑菌直徑比較Table 2 The comparison of diluted liquid antibacterial diameter

通過表1和表2可以看出，酸菜發(fā)酵液可選擇利用在40℃條件下，濃縮比例為300 mL∶60 mL=5∶1，粘稠度適中的濃縮液，利于鹽析。同時在此溫度下濃縮，濃縮液的抑菌能力對比濃縮溫度為0℃的原始離心上清液也很明顯，而在相同濃縮時間條件下，其它溫度的濃縮液抑菌效果相對不理想。

2.2 鹽析條件選擇

酸菜水最佳條件濃縮液濃度梯度鹽析結(jié)果見表3。

表3 濃度梯度鹽析沉淀量對比Table 3 The comparison of concentration gradient salting precipitation

通過表3可知，向酸菜濃縮液中加入25%（NH4）2SO4溶液后出現(xiàn)沉淀，離心后測定上清液和沉淀的抑菌效果。混合25%（NH4）2SO4溶液鹽析后的離心上清液，增大鹽析濃度到50%時，沉淀再次出現(xiàn)，離心后上清液和沉淀的抑菌效果見表4。

表4 抑菌圈直徑測定結(jié)果Table 4 The results of determination of bacteriostatic band diameter

表3和表4結(jié)果表明，25%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑明顯大于50%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑，說明25%（NH4）2SO4鹽析后的清液中還存在沒有被沉淀下來的抑菌物質(zhì)，需增大鹽濃度繼續(xù)鹽析。50%（NH4）2SO4鹽析沉淀抑菌直徑明顯大于 25%（NH4）2SO4鹽析沉淀抑菌直徑。說明用 50%（NH4）2SO4進行鹽析后，得到了存在于25%（NH4）2SO4鹽析上清液中的有效抑菌成分。50%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑略大于此時空白試驗的抑菌直徑，說明經(jīng)50%（NH4）2SO4鹽析后，上清液中絕大部分的抑菌成分已經(jīng)被沉淀出來，很少部分的抑菌成分還保留在清液中，根據(jù)鹽析濃度，推測該少部分的抑菌物質(zhì)可能是乳酸菌的次級代謝產(chǎn)物胞外多糖[16-17]，抑菌能力較弱。

2.3 透析物分離純化

收集25%和50%（NH4）2SO4梯度鹽析后的離心沉淀，經(jīng)過透析層析后，在280 nm下，用紫外可見分光光度計分別測定1～96號接收管內(nèi)液體的吸光值，并繪制吸光值曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 層析接收液吸光值曲線Fig.2 The curve of chromatography for receiving fluid absorption value

數(shù)據(jù)顯示出現(xiàn)兩個峰值波動，第一次峰值附近（28～35號管），認為是酸菜水中的大分子抑菌成分，屬于快速洗脫組分，予以收集，其中31號管出現(xiàn)最大吸光值，A280=0.195。第二次峰值附近（62～82號管），認為是酸菜水中小分子抑菌成分，含量較多，屬于較慢洗脫組分，予以收集，其中70號管出現(xiàn)最大吸光值，A280=0.316。選擇收集28～35、62～82號層析管內(nèi)液體組分，進行冷凍噴霧干燥處理制備凍干粉。

2.4 干粉性質(zhì)測定

冷凍噴霧干燥所得干粉的抑菌能力測定結(jié)果見表5。干粉具備蛋白質(zhì)性質(zhì)檢測結(jié)果見表6。

表5 相同濃度下物質(zhì)抑菌直徑比較Table 5 The comparison of bacteriostatic band diameter in same concentration

表6 胰蛋白酶處理前后中性干粉液抑菌直徑比較Table 6 The bacteriostatic diameter comparison of neutral powder liquid with trypsin added before and after

表6結(jié)果表明，pH調(diào)至中性的干粉液有明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑d=1.52 cm。用胰蛋白酶處理后，抑菌圈直徑d=0 cm，干粉液抑菌活性消失，即該干粉抑菌物質(zhì)可被蛋白酶分解，說明該物質(zhì)具備蛋白質(zhì)性質(zhì)。

電泳膠片經(jīng)脫色后可清晰看見Nisin、樣品干粉、Marker譜帶，具體結(jié)果見圖3。

圖3電泳照片表明Nisin分子量為3510 Da左右，干粉樣品分子量為3.5 ku和22 ku左右。顯示兩個分子量的值與吸光值測定試驗得到的兩個峰值的結(jié)果相吻合。

圖3 電泳膠片譜帶照片F(xiàn)ig.3 The photo of electrophoresis gel-film

3 結(jié)論

通過設計實驗從酸菜水中分離純化了乳酸桿菌HD1.7的肽類代謝產(chǎn)物。主要研究確定了原料在40℃下抽真空減壓濃縮5倍為最佳濃縮條件，在25%和50%兩個（NH4）2SO4鹽析濃度下可得到抑菌效果較好的有效成分。原料制備干粉后經(jīng)抑菌檢測顯示其具備較強的抑菌能力，經(jīng)胰蛋白酶檢測證實其可被蛋白酶分解，具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，同時電泳試驗確定了其具體分子量組成，主要包括3.5 ku和22 ku兩部分，這與實驗在280 nm下測得的含有效成分層析液的A280=0.195和A280=0.316兩個吸光峰值相吻合。由于分子量較小，說明提純物質(zhì)是小分子肽類。如果在鹽析層面上使用更高濃度的（NH4）2SO4進行，可能會得到新的沉淀，進而有可能更加標準化的確定該物質(zhì)的分子量組成。實驗研究為乳酸菌肽類代謝產(chǎn)物繼續(xù)深入化研究提供了可靠的依據(jù)，相信隨著食品工業(yè)的發(fā)展，這種小肽類防腐劑將會具有更廣闊的應用前景，也必將創(chuàng)造出更大的效益。

[1] 寧喜斌.乳酸菌素的特性及應用[J].上海水產(chǎn)大學學報,2002,11(3):289-294

[2] 孔祥智,黃雪松.硫酸銨鹽析法分步分離大蒜SOD和蒜氨酸酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(1):165-166

[3] 蔡春爾,何培民.硫酸銨三步鹽析對藻膽蛋白純化的影響[J].生物技術通報,2006(4):121-125

[4] 王世寬,冉燃,潘明,等.減壓處理對泡菜乳酸菌及風味物質(zhì)的影響[J].工業(yè)微生物,2010,40(2):46-48

[5] 雷虹,齊桂云,李秀涼,等.乳酸桿菌小分子抗菌肽產(chǎn)生菌的篩選及鑒定[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(7):671

[6] 葛菁萍,鄒鵬,宋剛,等.酸菜發(fā)酵液中乳酸菌的分離與鑒定[J].食品工業(yè)科技,2007,28(10):83-84

[7] 杜曉寧,宋明鳴.多肽類物質(zhì)分析檢測方法的研究進展[J].上?；?2009,34(11):6-9

[8] 張少飛,李敏,邢志國,等.產(chǎn)抑菌物質(zhì)SDLH菌株的鑒定及發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性研究[J].生物技術，2009,19(5):56-59

[9] 李敏,張少飛,刑志國，等.中華稻蝗內(nèi)生菌SDLH抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物技術，2008,18(6):78-81

[10]朱麗萍,顏世敢,李雁冰，等.硫酸銨鹽析條件對多管藻R-藻紅蛋白和R-藻藍蛋白得率和純度的影響[J].科技導報，2010,28(4):37-41

[11]馬賽箭,安超.乳鏈菌肽的發(fā)酵及分離純化工藝研究進展[J].保鮮與加工,2011,11(2):45-48

[12]楊歌德,姜玉梅,周宏博.凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)實驗中三種過濾介質(zhì)分離效果的比較[J].上海水產(chǎn)大學學報,2002,36(3):242-243

[13]李巧玲,劉景艷.紫外-可見分光光度法在食品分析中的應用[J].中國食品添加劑,2005(5):113-116

[14]黃群,麻成金,周姣,等.干燥方法及理化因素對鵪鶉蛋白粉功能特性的影響[J].食品科學,2008,29(10):299-302

[15]何榮海,馬海樂,肖海芳.條斑紫菜油脂與蛋白質(zhì)組成分析[J].食品與機械,2007,23(6):76-78

[16]梅秀明,潘道東.乳酸菌發(fā)酵液中胞外多糖的超濾濃縮技術研究[J].食品科學,2008,29(12):413-416

[17]張?zhí)扃?張雪,孔保華,等.東北酸菜中產(chǎn)胞外多糖乳桿菌的分離篩選及其在酸乳中的應用[J].中國乳品工業(yè),2009,37(7):8-12