不同前處理方法對保健食品中總皂苷含量測定的影響

彭維，李雙祁，歐愛芬

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510182；2.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東廣州510530；3.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州510160）

皂甙（saponins），是廣泛存在于植物界的一類特殊的甙類，在植物界分布很廣，許多中藥例如人參、三七、知母、遠志、甘草、桔梗、柴胡等都含有皂苷。皂苷由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有機酸組成[1]。有許多含皂苷類成分的中藥如遠志、桔梗等有祛痰止咳的功效[2]；有些皂苷還具有抗菌的活性或解熱[3]、鎮(zhèn)靜[4]、抗癌等有價值的生物活性[5-6]。在皂苷類成分的提取物中，往往伴隨著諸如糖類、鞣質(zhì)等親水性較強的成分，給皂苷類成分的分離純化增加了難度[7]。因皂苷的苷元部分多為疏水性，能被非極性樹脂所吸附，同時由于皂苷分子較大，故孔徑較大的D-101型大孔吸附樹脂為理想的選擇[8]。吸附后，很容易用水將糖類等親水性成分洗脫下來。再用適宜濃度的乙醇溶液將吸附在樹脂上的皂苷類成分洗脫，達到分離純化的目的[9]。目前，大孔吸附樹脂法提取分離皂苷已被廣泛應(yīng)用，如人參總皂苷[10]、三七總皂苷[11]、絞股藍總皂苷、毛冬青總皂苷等的提取分離。

傳統(tǒng)的比色法測定總皂苷含量時，一般只用大孔吸附樹脂對樣品進行純化、富集處理，很少對其進行脫色，而大孔吸附樹脂法只能去除提取液中的糖類、鞣質(zhì)和淀粉等雜質(zhì)，對色素的去除不理想，造成結(jié)果存在一定誤差。為了使實驗結(jié)果更接近于真實值，總皂苷的脫色純化處理成為重要一步。

1 試劑與儀器

1.1 材料

御和坊海狗丸（批號：20120101）；人參皂苷Re對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 儀器與試劑

U-3010 紫外可見分光光度計（HIACHI，Japan）、KUDOS超聲清洗器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；SG-4050型系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海碩光電子科技有限公司。

D-101大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂：山東魯抗醫(yī)藥有限公司；層析用中性氧化鋁：上海納輝干燥試劑廠，AR；95%乙醇（AR）、無水乙醇（AR）、甲醇（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR）、香草醛（AR）：廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 純化方法的比較

取海狗丸適量粉碎，精密稱取0.5 g試樣，置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水，超聲提取30 min，再用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，放置。

2.1.2 純化

分別精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液（2.1.1），分別過D-101大孔吸附樹脂柱、D-101大孔吸附樹脂和氧化鋁柱、D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，然后用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中。

2.1.3 對照溶液的制備

精密稱取一定量的人參皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分別吸取人參皂苷Re對照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 放蒸發(fā)皿上，按2.1.4置于60℃水浴揮干，進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系為y=0.0016x+0.0719，R2=0.9986。

2.1.4 測定

將2.1.2的純化洗脫液置于60℃水浴揮干，在已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入0.2 mL 5%的香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿，使殘渣都溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入10mL帶塞刻度離心管中，60℃水浴上加熱10min，取出，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0mL，搖勻后，以1 cm比色池于560 nm波長處測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總皂苷的含量。

2.1.5 回收的制定

很多教師在課堂練習(xí)中沒有將新課程標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)理念與實際教學(xué)相結(jié)合，只注重書面練習(xí)，其他形式相對缺乏，如社會實踐題、口頭練習(xí)和動手練習(xí)等；在課堂練習(xí)中單純注重基礎(chǔ)知識和基本技能的訓(xùn)練，缺少思維訓(xùn)練，未能認(rèn)識到學(xué)生個人思維的重要性。

精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液，另加對照品溶液（0.2mg/mL）1.0 mL與試樣一起純化測定。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性關(guān)系考察

精密稱取一定量的人參皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分別吸取人參皂苷Re對照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，過 D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，然后用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中。按2.1.4置于60℃水浴揮干，進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 精密度考察

精密吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)液（0.2 mg/mL）1.0 mL放蒸發(fā)皿上，水浴揮干（低于60℃），或熱風(fēng)吹干（勿使過熱），加適量蒸餾水溶解，過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，按2.1.4測定，測定6次，計算其RSD%值。

2.2.3 重復(fù)性考察

取試樣0.5 g，按“2.1.1預(yù)處理”后，精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液，過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，按2.1.4測定。分別進行6次平行試驗。

2.2.4 加樣回收試驗

精密吸取重復(fù)性考察時預(yù)處理好的試樣1.0 mL，共取 9 份，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)液（0.2 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL（60℃以下?lián)]干），配成高、中、低濃度試液各三份。過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，按2.1.4測定。

2.2.5 穩(wěn)定性考察

取重復(fù)性考察處理好的供試品液于0、2.5 h與5 h分別測定其吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 純化方法比較

表1 3種純化方法測定總皂苷含量及其回收率Table 1 The content of total saponins and its recovery of the three purification method

由于保健食品所含成分較為復(fù)雜，測定其中的總皂苷含量易受糖分、鞣質(zhì)、色素等成分的干擾。由表1看出，只經(jīng)D-101吸附樹脂純化的試樣，所測得樣品總皂苷含量最大，經(jīng)D-101吸附樹脂和氧化鋁純化的次之，經(jīng)D-101吸附樹脂與D-941離子交換樹脂純化的最小，而經(jīng)D-101與D-941樹脂的回收率最好，平均回收率達97.02%，其他兩種純化工藝的回收都欠佳。表明D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂除去保健食品中色素等其他雜質(zhì)效果良好，而且不影響總皂苷含量，適用于保健食品中總皂苷含量測定的除雜與純化。

3.2 方法學(xué)可行性分析

3.2.1 線性關(guān)系考察

試驗結(jié)果圖1表明，人生皂苷Re檢測質(zhì)量在0.02 mg～0.4 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.001 6x+0.071 9，R2=0.998 6。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve

3.2.2 精密度考察

表2 精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 2 Precision of test results

由表2試驗結(jié)果可見，6次測定結(jié)果的RSD值為0.27%，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯(lián)用純化樣品的測定方法精密度較好。

3.2.3 重復(fù)性考察

表3 重復(fù)性數(shù)據(jù)Table 3 Repeatability data

由表3試驗結(jié)果可見，6次測定結(jié)果的RSD值為0.79%，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯(lián)用純化樣品的測定方法重復(fù)性較好。

3.2.4 加樣回收試驗

表4 加樣回收數(shù)據(jù)Table 4 Recovery test data

由表4的試驗結(jié)果可見，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯(lián)用純化樣品的平均回收率為98.62%，RSD值為1.66%（n=9），證實了該方法能有效地用于保健品中總皂苷的含量測定。

3.2.5 穩(wěn)定性考察

結(jié)果表明，其吸光度在5h內(nèi)人生皂苷Re及樣品溶液的吸光度變化很小，穩(wěn)定性好，平均RSD為1.21%。

表5 穩(wěn)定性數(shù)據(jù)Table 5 Stability data

4 結(jié)論與討論

保健食品中所含成分復(fù)雜，易對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。本實驗所用海狗丸主要原料為海狗精粉、人參、淮山藥、茯苓、熟地、淫羊藿、肉桂、淀粉硬脂酸鎂等，除皂苷外還含有大量的色素等其他雜質(zhì)。本實驗過程中，試液過D-101大孔吸附樹脂后的洗脫液呈黃色，吸光度值最大，而過加氧化鋁的D-101吸附樹脂的洗脫液顏色相對較淡，吸光度次之，表明氧化鋁有一定的脫色作用，但脫色不完全；過D-101吸附樹脂后的洗脫液再過D-941離子交換樹脂，洗脫液呈現(xiàn)無色透明，其吸光度值最小，表明D-941離子交換樹脂的脫色效果明顯。而且從這3種純化方法的加樣回收來看，前兩種的回收率分別為94.86%和92.34%，回收率較低，而過D-941離子交換樹脂的試樣回收率達97.02%，遠高于前兩種。表明D-941離子交換樹脂脫色能力強，且不會吸附總皂苷，適用于保健食品中總皂苷的脫色純化處理。

本實驗用D-101大孔吸附樹脂與D-941離子交換樹脂柱聯(lián)用對保健食品中的總皂苷進行脫色純化處理，以人參皂苷Re為對照品做校正曲線，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.001 6x+0.071 9（R2=0.998 6，n=5），加樣回收率為 98.62%，RSD=1.66%，精密度，重復(fù)性好，可作為保健食品中總皂苷測定的方法，對保健品質(zhì)量的控制具有重要的意義。

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