直接稀釋-液相色譜法快速測定葡萄酒中的甘油和糖

葛寶坤，楊爽，俞子萱，趙濱巖

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

近年來，隨著人們生活水平的提高，葡萄酒已逐漸成為普通百姓餐桌上的重要飲品，但葡萄酒被檢出標簽不合格、重金屬、添加劑超限量使用、生產(chǎn)劣質(zhì)假冒葡萄酒的情況時有發(fā)生[1]，因此葡萄酒的真?zhèn)闻c質(zhì)量的好壞是關系到人們身體健康的重要因素。葡萄酒的釀造是糖類化合物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程，甘油則是發(fā)酵過程中生成的主要副產(chǎn)物之一，存在于各類葡萄酒中，是干型、半干型葡萄酒的主要組成成分，酒精發(fā)酵過程中多產(chǎn)甘油可使酒味醇和圓潤，是決定葡萄酒質(zhì)量的主要成分[2]，檢測甘油含量可以為鑒定原酒含量、識別摻假酒提供依據(jù)；葡萄酒中的總糖量是影響葡萄酒質(zhì)量和區(qū)分葡萄酒種類的重要指標之一[3]，檢測葡萄酒中含糖量一是了解葡萄汁發(fā)酵的程度，二是測定葡萄酒中含糖量，三是計算出葡萄酒中的干浸出物，根據(jù)GB2760-2011《食品添加劑衛(wèi)生標準》，葡萄酒中不得添加任何形式的糖醇，對葡萄酒進行本地調(diào)查，建立相關產(chǎn)地葡萄酒中甘油、糖的種類、含量信息庫顯得尤為重要。

目前檢測葡萄酒中甘油和含糖量的方法較多，如氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-6]、衍生-GC-MS 法[1]、SPE凈化-液相色譜法[7]、液相色譜-蒸發(fā)光散射法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、化學法[11-12]等，但上述方法或存在檢測靈敏度低、或存在操作繁瑣復雜、或存在檢測成本高、設備購置昂貴等不足；本法采用30%的乙腈水直接稀釋-液相色譜分離-視差折光檢測器檢測同時測定葡萄酒中甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖化合物含量的方法未見報道，實驗研究結果表明，該方法克服了上述文獻方法中的不足，且具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定、污染小、檢測成本低等特點，便于批量檢測的推廣與應用。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀（配2414視差遮光檢測器）：Waters公司；MILLI-Q純水儀：MILLIPORE公司；固相萃取柱（型號：SAX；規(guī)格：150 mg/3 mL）：北京迪馬科技公司。

1.2 試劑

乙腈：色譜純；甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖（分析純含量≥99%）：天津化學試劑三廠生產(chǎn)；甘油、糖混合標準儲備液的配制：分別準確稱取一定量的上述標準品，用去離子水溶解、混勻、定容，即為標準儲備液，其中果糖、葡萄糖、蔗糖濃度為20.0 mg/mL，甘油濃度為10 mg/mL；標準使用液是將儲備液用去離子水稀釋至所需要的濃度。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

取2 mL葡萄酒樣于15 mL離心管中，用30%的乙腈水直接稀釋定容至10 mL，混勻，過0.45 μm濾膜作為甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖分離樣液進高效液相色譜儀分析測定。

1.3.2 高效液相色譜條件

色 譜 柱 ：WATERS，ENERGY ANALYSIS NH2，300 mm×3.9 mm，10 μm，或相當者；流動相：乙腈+水=80%+20%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測池溫度：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 分析測定

根據(jù)樣液中被測甘油、糖的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液，標準工作液和待測樣液中甘油、糖的響值均應在工作曲性范圍內(nèi)，對標準工作液和待測樣液等體積參插進樣測定。

2 結果與討論

2.1 方法的回收率與精密度

在1.3.2的色譜條件下，標準品色譜圖和保留時間見圖1。

圖1 色譜條件下標準品色譜圖Fig.1 Standard chromatograph

取葡萄酒樣品2 mL，按照0.25、2.5、25.0 g/L 3個加標水平，按本方法進行加標回收試驗，并做6個平行樣，結果為甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率均在96%～102%，精密度小于8.0%，本方法的穩(wěn)定性良好，結果見表1。

2.2 方法的標準曲線及線性關系

取一定濃度混合標準溶液，用30%的乙腈水分別稀釋成濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0、5.0mg/mL，按照本方法色譜條件分析測定，繪制工作曲線，4種成分在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性關系，其相關系數(shù)均大于0.999 5，結果見表1。

表1 方法的加標回收率、變異系數(shù)、檢測限（n=10）Table 1 The Recovery，correlation-coefficient，LOD，LOQ（n=10）

2.3 方法的測定限

取葡萄酒樣品約2 mL，加入混合標準溶液2 mL，逐級稀釋后按照本方法色譜條件測定樣品加標結果，根據(jù)信噪比S/N=10為本方法的定量限（LOQ）、S/N=3為本方法的定性限（LOD）計算出方法的最低檢測限，結果見表1。

2.4 方法的適用性

為了確定方法的抗干擾能力及適用性，分別選取常見的干紅、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒樣品，按照本方法條件進行測試，結果顯示四種待測組分的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，樣品中的色素有機酸、揮發(fā)性酚、醛類等成分均不干擾結果測定。

2.5 稀釋液配比的優(yōu)化

研究了水、甲醇水、乙腈水直接稀釋法對測定結果的影響，研究表明：甲醇水因含有醇羥基對視差折光檢測器有較大的吸收而影響測試結果；直接用水稀釋不僅會形成較大的水峰，而且水峰還不能與甘油峰完全分開，造成測試結果的偏離；另對乙腈水的配比研究還發(fā)現(xiàn)：采用30%的乙腈水直接稀釋樣品可使水峰較小、水峰與甘油的保留時間相差1.0 min、4種待測成分分離較高、基線噪音低，因此，本研究優(yōu)選30%的乙腈水（體積比）為樣品直接稀釋液。

2.6 本方法與GB/T15038-2006中的SPE方法比較

為確定本方法具有簡便、快速、靈敏、成本低的特點，應用本方法與國標方法GB/T15038-2006的SPE法，對天津口岸來自美國、法國、意大利、智力、西班牙、羅馬尼亞共16批次的葡萄酒樣品的測試結果比較發(fā)現(xiàn)，在待測組分含量≤1.0g/L時，SPE方法測定結果的穩(wěn)定相較差，變異系數(shù)大于10%，待測組分含量≥1.0 g/L時，二者測試結果的差別無顯著性。因此，直接稀釋法較SPE法更具有操作簡單、快速，不需要SPE凈化柱、試劑消耗少、對環(huán)境污染小等特點。

3 結果

本文研究的檢測方法4種待測組分在0.05mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關系，相關系數(shù)大于0.999 5；樣品在0.25、2.5、25.0 g/L 3個加標水平內(nèi)的回收率范圍為96%～102%，6次測定的相對標準偏差小于8.0%；方法的定性檢出限（LOD）為0.04 g/L、定量檢出限（LOD）為0.10 g/L，符合色譜分析的方法要求。本研究方法較國標SPE法更具有操作簡單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱、試劑消耗少、對環(huán)境污染小等特點，便于推廣與應用。

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