甘藍(lán)型油菜葉片組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

申靜靜++廖玉才++李和平

摘要：以甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）葉片為材料，分析了影響油菜葉片離體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素——基因型、基本培養(yǎng)基、激素配比及外植體取材時(shí)間，優(yōu)化了油菜葉片組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，

關(guān)鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；葉片；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）02-0447-03

The Optimization of Regeneration System of Rapeseed（Brassica napus L.） Leaf

SHEN Jing-jinga，LIAO Yu-caib，LI He-pinga

（a.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Life Science and Technology； b.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China）

Abstract： Using leaf as explants from Brassica napus and focusing on factors（genotype， basic media， the hormones combinations and seeding age of explants） affecting the leaves regeneration in vitro， an effective regeneration system was established. The results showed that MS+4 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA was best for shooting， with differentiation and regeneration rate of 75.2% and 28.1%， respectively 1/2 MS+1 mg/L IBA was best for rooting， with the rooting rate of 100%. The explants of different seeding age from the same genotype showed great difference of shooting differentiation and regeneration capability. The 22-day leaf of F4 cultivar was the best explant for tissue culture.

Key words： Brassica napus L.； leaf； tissue culture

油菜（Brassica napus L.）是我國(guó)主要的油料作物之一[1]。近年來(lái)，隨著高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，油菜高頻率植株再生組織培養(yǎng)體系是進(jìn)行外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，因此，探討油菜離體培養(yǎng)中不定芽分化和成苗的影響因素具有重要意義。自1974年Kartha等[2]首次從甘藍(lán)型油菜的莖切段組織培養(yǎng)誘導(dǎo)分化獲得植株以來(lái)，花序軸[3]、帶柄子葉[4，5]、下胚軸[6，7]、葉片[8-10]和子葉[11，12]等外植體被成功應(yīng)用于油菜離體誘導(dǎo)獲得再生植株。本研究主要以F4和T15油菜品系的子葉為外植體，篩選合適于組織培養(yǎng)的基因型；以F4第18、22天苗齡的葉片為外植體，進(jìn)一步優(yōu)化了分化和生根培養(yǎng)基，建立了甘藍(lán)型油菜F4品系葉片的再生體系，為通過(guò)油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得優(yōu)良性狀的甘藍(lán)型油菜奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

油菜F4和T15品系由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.3 方法

1.3.1 種子的消毒與無(wú)菌苗的獲得 挑選種皮完好、飽滿的油菜種子，70%乙醇消毒2 min，無(wú)菌水沖洗1次，15% H2O2滅菌35 min，無(wú)菌水沖洗3次。將種子置于B5基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯幼苗移至B5基本培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，16 h/8 h（光照/黑暗）。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及分化 挑選5～6 d的子葉，將子葉切成3 mm×3 mm大小，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)培養(yǎng)8周后，轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)，每2周繼代一次。誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，分化培養(yǎng)4～6周時(shí)進(jìn)行分化率和成苗率統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%；分化率=至少分化出一個(gè)根或芽的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%；成苗率=至少出現(xiàn)一株苗的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%。

1.3.3 不同分化培養(yǎng)基對(duì)外植體芽、苗分化的影響 取苗齡18、22 d的葉片作為外植體，將葉片切成3 mm×3 mm大小，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基均為A，愈傷組織接種到不同分化培養(yǎng)基上。每2周繼代一次，分化培養(yǎng)4～6周時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分化率，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)有A與B①、A與B②、A與B③、A與B④、A與B⑤、A與B⑥、A與B⑦、A與B⑧、A與B⑨等處理。數(shù)據(jù)采用Excel和SAS軟件處理，對(duì)分化率和成苗率統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

1.3.4 生根培養(yǎng)基對(duì)外植體生根的影響 待芽、苗生長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，去掉多余的愈傷組織移至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)生根率。生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)油菜組織培養(yǎng)的影響

對(duì)F4和T15子葉進(jìn)行相同條件下的愈傷誘導(dǎo)和愈傷分化培養(yǎng)，2周時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，4～6周時(shí)統(tǒng)計(jì)分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導(dǎo)率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進(jìn)行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對(duì)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，而是針對(duì)分化率和成苗率進(jìn)行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達(dá)到75.2%，成苗率可達(dá)28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜愈傷組織生根誘導(dǎo)的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況結(jié)果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)100%，生根較快，誘導(dǎo)的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)幼苗和不定根的伸長(zhǎng)也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導(dǎo)生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導(dǎo)。

3 小結(jié)與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導(dǎo)率可達(dá)98.3%，18 d和22 d葉片的誘導(dǎo)率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導(dǎo)率均低于這個(gè)水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導(dǎo)芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結(jié)果相似。6-BA濃度為4 mg/L時(shí)，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導(dǎo)致“玻璃化”現(xiàn)象嚴(yán)重；濃度低時(shí)，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時(shí)，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對(duì)生根效率和長(zhǎng)勢(shì)也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導(dǎo)率和分化率。對(duì)F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進(jìn)行再生試驗(yàn)，結(jié)果表明，22 d的葉片愈傷誘導(dǎo)率和分化率最高。這樣取材時(shí)間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時(shí)間，而且可以獲得更高的成苗率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉國(guó)紅，梁明祥，周詩(shī)雨，等.甘藍(lán)型油菜南鹽油1號(hào)不同外植體體系的比較研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（3）：42-46.

[2] KARTHA K K， GAMBORG O L， CONSTABEL F. In vitro plant formation from stem explants of rape（Brassica napus cv. Zephyr） [J]. Physiol，1974，31（3）：217-220.

[3] 韓德俊，曹 莉，袁本威，等.甘藍(lán)型油菜花莖高效再生體系研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，2005，12（6）：86-88.

[4] 王 艷，賀 賓，曾幼玲，等.甘藍(lán)型油菜帶柄子葉的高頻植株的研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2004，26（4）：86-90.

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[6] 王俊生，范小芳，譚光軒，等.甘藍(lán)型黃籽油菜高油品系下胚軸體系的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：45-48.

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[9] 王艾平，趙 紅，林國(guó)衛(wèi)，等.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)甘藍(lán)型油菜愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（8）：797-799.

[10] 周吉源，程井辰，王家訓(xùn).油菜花序軸、葉片組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞組織學(xué)研究[J].武漢植物學(xué)研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 剛，石淑穩(wěn)，魏澤蘭，等.甘藍(lán)型冬性和半冬性油菜子葉高效快速芽體系的建立[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（3）：1-5.

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[14] 王景雪，孫 毅.蕓薹屬（Brassica）植物的組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，16（3）：9-14.

[15] 王景雪， 孫 毅， 崔貴梅，等.在油菜組織培養(yǎng)中激素及基因型對(duì)下胚軸分化的影響[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑穩(wěn)，周永明.甘藍(lán)型油菜下胚軸培養(yǎng)和高頻率芽再生技術(shù)的研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，1998，20（2）：1-6.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)油菜組織培養(yǎng)的影響

對(duì)F4和T15子葉進(jìn)行相同條件下的愈傷誘導(dǎo)和愈傷分化培養(yǎng)，2周時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，4～6周時(shí)統(tǒng)計(jì)分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導(dǎo)率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進(jìn)行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對(duì)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，而是針對(duì)分化率和成苗率進(jìn)行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達(dá)到75.2%，成苗率可達(dá)28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜愈傷組織生根誘導(dǎo)的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況結(jié)果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)100%，生根較快，誘導(dǎo)的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)幼苗和不定根的伸長(zhǎng)也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導(dǎo)生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導(dǎo)。

3 小結(jié)與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導(dǎo)率可達(dá)98.3%，18 d和22 d葉片的誘導(dǎo)率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導(dǎo)率均低于這個(gè)水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導(dǎo)芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結(jié)果相似。6-BA濃度為4 mg/L時(shí)，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導(dǎo)致“玻璃化”現(xiàn)象嚴(yán)重；濃度低時(shí)，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時(shí)，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對(duì)生根效率和長(zhǎng)勢(shì)也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導(dǎo)率和分化率。對(duì)F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進(jìn)行再生試驗(yàn)，結(jié)果表明，22 d的葉片愈傷誘導(dǎo)率和分化率最高。這樣取材時(shí)間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時(shí)間，而且可以獲得更高的成苗率。

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[6] 王俊生，范小芳，譚光軒，等.甘藍(lán)型黃籽油菜高油品系下胚軸體系的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：45-48.

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[8] YOKO A K， HIDEFUMI Y， YOSHIHITO T. Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed（Brassica napus L.）： The influence of AgNO3 and genotype[J]. Plant Cell Rep，2005，24（11）：649-654.

[9] 王艾平，趙 紅，林國(guó)衛(wèi)，等.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)甘藍(lán)型油菜愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（8）：797-799.

[10] 周吉源，程井辰，王家訓(xùn).油菜花序軸、葉片組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞組織學(xué)研究[J].武漢植物學(xué)研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 剛，石淑穩(wěn)，魏澤蘭，等.甘藍(lán)型冬性和半冬性油菜子葉高效快速芽體系的建立[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（3）：1-5.

[12] CHENG L， LI H P， QU B， et al. Chloroplast transformation of rapeseed（Brassica napus） by particle bombardment of cotyledons[J]. Plant Cell Rep，2010，29（4）：371-381.

[13] 韓善華，鄭國(guó)锠.油菜（Brassica napus L.） 葉片植株的再生[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1983，16（1）：1-7.

[14] 王景雪，孫 毅.蕓薹屬（Brassica）植物的組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，16（3）：9-14.

[15] 王景雪， 孫 毅， 崔貴梅，等.在油菜組織培養(yǎng)中激素及基因型對(duì)下胚軸分化的影響[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑穩(wěn)，周永明.甘藍(lán)型油菜下胚軸培養(yǎng)和高頻率芽再生技術(shù)的研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，1998，20（2）：1-6.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)油菜組織培養(yǎng)的影響

對(duì)F4和T15子葉進(jìn)行相同條件下的愈傷誘導(dǎo)和愈傷分化培養(yǎng)，2周時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，4～6周時(shí)統(tǒng)計(jì)分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導(dǎo)率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進(jìn)行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對(duì)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，而是針對(duì)分化率和成苗率進(jìn)行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達(dá)到75.2%，成苗率可達(dá)28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)油菜愈傷組織生根誘導(dǎo)的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況結(jié)果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)100%，生根較快，誘導(dǎo)的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)幼苗和不定根的伸長(zhǎng)也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導(dǎo)生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導(dǎo)。

3 小結(jié)與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導(dǎo)率可達(dá)98.3%，18 d和22 d葉片的誘導(dǎo)率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導(dǎo)率均低于這個(gè)水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導(dǎo)芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結(jié)果相似。6-BA濃度為4 mg/L時(shí)，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導(dǎo)致“玻璃化”現(xiàn)象嚴(yán)重；濃度低時(shí)，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時(shí)，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對(duì)生根效率和長(zhǎng)勢(shì)也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導(dǎo)率和分化率。對(duì)F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進(jìn)行再生試驗(yàn)，結(jié)果表明，22 d的葉片愈傷誘導(dǎo)率和分化率最高。這樣取材時(shí)間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時(shí)間，而且可以獲得更高的成苗率。

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