番茄采后灰霉病原對幾種抑菌劑的敏感性研究

孫 昊 張萬萍 孟繁博 余定浪

SUN Hao 1 ZHANG Wan－ping 1 MENG Fan－buo 2 YU Ding－lang 2

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

（1.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；2.School of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

番茄（Solanum lycopersicum）是一種廣泛種植的經(jīng)濟作物，隨著反季節(jié)栽培面積的增加，運輸番茄在調(diào)劑市場方面發(fā)揮了積極的作用，番茄采后貯存或運輸過程中，采后病害的發(fā)生會導(dǎo)致果實不同程度的腐爛，嚴(yán)重影響貨架期和商品性價值，造成一定的經(jīng)濟損失。

番茄采后病害的發(fā)生一般包括生理性病害和侵染性病害，灰霉病是常見的侵染性病害，病原真菌是灰葡萄孢（Botrytis cinerea），屬于鏈孢霉目、鏈孢霉科，分布廣泛易傳染，可感染多種植物引發(fā)灰霉病，而且可以二次侵染，加重病害流行［1］，造成果實的腐爛。與其它采后病害相比，灰葡萄孢不僅表現(xiàn)出明顯的潛伏侵染優(yōu)勢，而且在低溫（4℃）條件下仍具有較強的致病性，能夠侵染200多種植物，致病力強，具有能夠長期潛伏侵染、適應(yīng)寄主生理狀態(tài)和降低寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)的共生親和功能。因此，研究番茄采后灰霉病的防治具有重要意義。

對于番茄采后病害，傳統(tǒng)的防治方法是以低溫結(jié)合化學(xué)抑菌劑進(jìn)行處理，但化學(xué)抑菌劑處理方法導(dǎo)致的病原菌抗藥性和農(nóng)殘問題備受爭議。近年來，有研究［2］表明利用病原菌的拮抗菌進(jìn)行生物防治具有很好的效果，但由于拮抗菌抑菌所需濃度高、不具備廣譜抑菌性，難以完全取代傳統(tǒng)防治方法［3］。也有研究將采后熱處理［4］、涂膜處理等方法與上述防治方法結(jié)合［5］，得到了良好的效果。果蔬保鮮抑菌劑對于采后病害的防治具有顯著效果，并且具有低毒、高效、廣譜的優(yōu)點。GB 2760－2011規(guī)定能夠在果蔬表面使用的抑菌劑有納他霉素、茶多酚、植酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫醋酸鈉。本試驗擬采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)曲線法，研究幾種抑菌劑對灰葡萄孢菌絲和孢子的抑制作用，以篩選效果好的抑菌劑進(jìn)行復(fù)配，用以防治番茄采后灰霉病。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

納他霉素：色譜級，≥95%，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

茶多酚：分析純，南通飛宇生物科技有限公司；

植酸：分析純，≥50%，天津市博迪化工有限公司；

苯甲酸鈉：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

山梨酸鉀、雙乙酸鈉、脫氫乙酸鈉：食品級，南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平：FA2204B型，上海精科天美有限公司；

自動高壓滅菌鍋：LS－B75L－Ⅰ型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；

冰箱：BCD－216型，青島海爾電冰箱有限公司；

超凈工作臺：SW－CJ－1D／1G 型，蘇州市凈化設(shè)備有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：250D型，金壇市三和儀器有限公司；

光學(xué)顯微鏡：E10型，上海尼康儀器有限公司。

1.1.3 病原菌

灰葡萄孢菌株：由本試驗室從感染的番茄上分離獲得，經(jīng)純化、回接以及DNA鑒定確定病原菌。用于菌株分離的樣本，于貴州番茄灰霉病多發(fā)區(qū)域的田間采集。

1.1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂條20 g，蒸餾水1 000 m L。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同抑菌劑對灰葡萄孢的離體抑制作用

（1）抑菌劑介質(zhì)平板的配制：采用試管二倍比稀釋法，將每種抑菌劑配成所需濃度梯度的藥液。然后按比例移取藥液及培養(yǎng)基，加到培養(yǎng)皿中，充分混勻，冷卻凝固，制成一定不同濃度梯度的抑菌劑介質(zhì)平板，現(xiàn)用現(xiàn)制?？瞻讓φ沼脽o菌水代替藥液。

（2）不同抑菌劑對番茄灰葡萄孢的最低抑菌濃度（MIC）的測定：根據(jù)一般抑菌劑量，植酸以2.5%的體積分?jǐn)?shù)作為最高濃度，其余以1 g／L作為最高濃度，每種抑菌劑介質(zhì)平板設(shè)8個濃度梯度，采用試管二倍比稀釋法制成相應(yīng)濃度的抑菌劑介質(zhì)平板，每個濃度設(shè)3次平行，制好備用。準(zhǔn)備106個／m L濃度的孢子懸浮液，吸取50μL至抑菌劑介質(zhì)平板表面，用玻棒均勻涂布，21℃下倒置恒溫培養(yǎng)，直至對照組中菌落鋪滿平板，觀察生長情況，記錄各抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）。

（3）不同抑菌劑對番茄灰葡萄孢的毒力測定：采用菌絲生長速率法測定幾種抑菌劑的毒力回歸方程和抑制中濃度。根據(jù)以上試驗8個濃度梯度間抑制率的顯著性差異和最低抑菌濃度（MIC），選擇合適的起始濃度，采用倍比稀釋法制成含毒介質(zhì)平板，設(shè)5個濃度梯度，每個濃度設(shè)3次平行，制好備用。然后沿灰葡萄孢菌落邊緣，取直徑7 mm的菌塊，倒置接種于抑菌劑介質(zhì)平板中央，然后21℃恒溫培養(yǎng)，直至對照組的菌落直徑生長至培養(yǎng)皿直徑1／2～2／3時，記錄生長情況，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按式（1）計算生長抑制率。所得數(shù)據(jù)利用Origin統(tǒng)計軟件，計算出毒力回歸方程和抑制中濃度EC50。

1.2.2 不同抑菌劑對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

（1）灰葡萄孢孢子的收集和孢子懸浮液的配制：將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，22℃下培養(yǎng)，至菌落表面大量產(chǎn)孢，向平皿中加入適量0.3%吐溫－80水溶液，并用刀片輕刮菌落表面，然后將含孢子的渾濁液震蕩10 min，用雙層吸水紙過濾，濾去菌絲，然后低速（3 000 r／min）離心3 min，棄上清，然后加入少量0.3%吐溫－80水溶液震蕩溶解，然后用血球計數(shù)板觀察計算孢子懸浮液的濃度，并將其稀釋至105U／m L，現(xiàn)用現(xiàn)制［6］。

（2）不同抑菌劑對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響：由于灰葡萄孢孢子在清水中幾乎不萌發(fā)，因此采用在PDA培養(yǎng)基上涂布孢子懸浮液使其萌發(fā)的方法［7］。先將不同抑菌劑配制成濃度為EC50和EC90的含毒介質(zhì)平板（控制培養(yǎng)基厚度≤3 mm），吸取0.1 m L孢子懸浮液，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，切取1.5 cm×1.5 cm左右大小的小塊，正面向上置于載玻片中央，然后放置于滅菌平板內(nèi)保濕，21℃黑暗培養(yǎng)觀察，培養(yǎng)5 h后開始觀察孢子萌發(fā)情況，每隔1 h記錄1次，記錄5次后停止，等24 h后再觀察一次，并按式（2）計算孢子萌發(fā)率。每個處理設(shè)3次平行，隨機觀察不少于3個以上視野，觀察孢子總數(shù)不少于100個，記錄孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)。以孢子芽管超過孢子直徑視為萌發(fā)［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 幾種抑菌劑對灰葡萄孢的最低抑菌濃度（MIC）

從試驗結(jié)果（表1）可以看出，7種抑菌劑對灰葡萄孢的生長均有抑制效果，但抑菌效果有所差異：其中納他霉素的MIC最低，為62.5 mg／L，對灰葡萄孢的生長有很好的抑制效果；植酸和脫氫乙酸鈉對灰葡萄孢的生長抑制效果中等；苯甲酸鈉、山梨酸鉀和雙乙酸鈉的抑制效果較差，濃度超過1 g／L時才能達(dá)到完全抑制；而茶多酚雖有抑制，但是不能達(dá)到完全抑制。

由表2可知，茶多酚對灰葡萄孢的抑制率隨濃度增加呈現(xiàn)一個先高后低的變化趨勢，而其它6種抑菌劑抑制效果隨濃度變大而增加。其原因可能是由于茶多酚雖然具備一定的廣譜抑菌效果，但對于灰葡萄孢的生長存在某種促進(jìn)作用，并與茶多酚的抑制作用相疊加，當(dāng)濃度較高時，促進(jìn)作用大于抑制作用，表現(xiàn)出較弱的抑制；當(dāng)濃度較低時，抑制作用和促進(jìn)作用都較低，表現(xiàn)出較弱的抑制；當(dāng)濃度適中時，兩作用疊加產(chǎn)生的抑制作用最大，約為60%。

表1 幾種抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration（MIC）of several antimicrobial agents

表1 幾種抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration（MIC）of several antimicrobial agents

茶多酚對灰葡萄孢僅有弱抑制作用，不能全部抑制生長；植酸的濃度為體積分?jǐn)?shù)。

抑菌劑 最低抑菌濃度納他霉素 0.062 5 g／L抑菌劑 最低抑菌濃度山梨酸鉀 2.0 g／L茶多酚 －植酸 0.156 25%苯甲酸鈉 1.0 g／L雙乙酸鈉 2.0 g／L脫氫乙酸鈉 0.125 g／L

表2 茶多酚的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of tea polypheno

2.2 不同抑菌劑對番茄灰葡萄孢的抑制作用比較

試驗采用菌絲生長速率法，通過選取抑制率適中的5個抑菌濃度進(jìn)行試驗，并對結(jié)果進(jìn)行線性擬合，求得毒力回歸方程和EC50（表3）。比較可得幾種抑菌劑的EC50：納他霉素＜脫氫乙酸鈉＜苯甲酸鈉＜山梨酸鉀＜雙乙酸鈉＜植酸（折算濃度為687.9 mg／L）。其中納他霉素和脫氫乙酸鈉的EC50最低，比其它抑菌劑濃度低一個數(shù)量級，僅需21.54 mg／L和33.99 mg／L，對灰葡萄孢的菌絲生長有良好抑制效果。

2.3 幾種抑菌劑對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

由于抑菌劑實際使用濃度多集中在抑制菌絲生長的EC50和EC90之間，菌絲的抑制效果相近，所以比較當(dāng)各抑菌劑濃度為EC50和EC90時，對孢子萌發(fā)的影響，便于綜合比較抑菌能力。

抑菌劑對于孢子萌發(fā)的作用分為兩種：降低最終的孢子萌發(fā)率和延緩達(dá)到最終孢子萌發(fā)率的時間，即萌發(fā)速度。由表4可知，21℃黑暗培養(yǎng)灰葡萄孢孢子萌發(fā)速度萌發(fā)率在8～9 h后變化基本趨于穩(wěn)定，并且由于24 h后再萌發(fā)的孢子對整個菌落生長影響較小，所以把24 h后的萌發(fā)率看作最終的孢子萌發(fā)率，作為抑菌力大小的指標(biāo)進(jìn)行比較。

表3 幾種抑菌劑的抑菌毒力方程和EC 50Table 3 Antibacterial virulence equation and EC 50 of several antimicrobial agents

表3 幾種抑菌劑的抑菌毒力方程和EC 50Table 3 Antibacterial virulence equation and EC 50 of several antimicrobial agents

茶多酚不符合線性分布，無法得到毒力回歸方程。

抑菌劑 毒力回歸方程 相關(guān)系數(shù)R 2 EC 50 EC 90納他霉素 y ＝ 12.86x＋0.223 0.970 21.54 mg／L 52.64 mg／L茶多酚 － － － －植酸 y ＝ 614.5x＋0.171 0.971 0.053 54% 0.118 6%苯甲酸鈉 y ＝ 0.893x＋0.308 0.962 215.0 mg／L 662.9 mg／L山梨酸鉀 y ＝ 0.697x＋0.130 0.909 530.8 mg／L 1 105.0 mg／L雙乙酸鈉 y＝0.42x＋0.183 0.838 754.8 mg／L 1 707.0 mg／L脫氫乙酸鈉 y ＝ 10.12x＋0.156 0.953 33.99 mg／L 73.52 mg／L

表4 幾種抑菌劑對灰葡萄孢孢子萌發(fā)率的影響Table 4 Effect of several antimicrobial agents on Botrytis cinerea spore germination rate

表4 幾種抑菌劑對灰葡萄孢孢子萌發(fā)率的影響Table 4 Effect of several antimicrobial agents on Botrytis cinerea spore germination rate

茶多酚選取抑制率高的0.05 g／L濃度和抑制率中等的0.1 g／L濃度進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗，以便于比較。

抑菌劑種類及濃度孢子萌發(fā)率／%5 h 6 h 7 h 8 h 9 h 24 h納他霉素茶多酚EC 50 EC 90 0.05 g／L 0.1 g／L植酸苯甲酸鈉山梨酸鉀雙乙酸鈉脫氫乙酸鈉EC 50 EC 90 EC 50 EC 90 EC 50 EC 90 EC 50 EC 90 EC 50 EC 90對照組0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 49.8 57.5 65.3 73.7 97.4 58.8 91.7 93.3 94.9 94.9 97.3 43.5 71.1 85.3 90.4 93.5 97.3 3.6 5.0 21.1 32.8 42.9 50.0 59.8 79.0 87.2 92.4 93.6 95.6 36.8 54.3 61.5 69.2 78.2 89.7 21.2 23.8 26.7 35.5 39.4 50.0 20.5 21.9 23.5 27.2 33.5 40.0 19.6 26.3 42.1 61.3 82.2 96.5 40.5 64.1 72.0 82.1 88.4 96.8 53.3 84.6 87.6 92.6 94.5 95.8 45.8 66.1 75.9 81.8 86.1 92.3 0.552 55.2 68.8 74.0 86.0 91.1

2.3.1 幾種抑菌劑對孢子抑制力的比較 根據(jù)表4，將各抑菌劑EC90濃度下的孢子萌發(fā)曲線進(jìn)行橫向比較，由圖1可知：① 納他霉素可以完全抑制孢子萌發(fā)；② 植酸和山梨酸鉀不僅可以延緩萌發(fā)速度，同時可以大幅降低最終孢子萌發(fā)率，孢子萌發(fā)抑制率在50%以上；③ 苯甲酸鈉只能延遲灰葡萄孢孢子的萌發(fā)速度，對最終孢子的萌發(fā)率影響較??；④ 雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉對灰葡萄孢的萌發(fā)影響較弱；⑤ 而茶多酚可以大幅提高孢子萌發(fā)速度，處理組6 h的萌發(fā)率已達(dá)91.7%，高于對照組24 h的萌發(fā)率91.1%。

圖1 幾種抑菌劑EC 90濃度下的孢子萌發(fā)曲線Figure 1 Spore germination curve for several antimicrobial agents at the concentration of EC 90

2.3.2 幾種抑菌劑濃度與抑制效果的關(guān)系 根據(jù)圖2，將各抑制劑不同濃度下的孢子萌發(fā)曲線進(jìn)行縱向比較，可知各抑菌劑的抑菌效果對抑菌劑濃度的依耐性情況，其中：① 納他霉素和山梨酸鉀在EC50濃度下，依然對孢子萌發(fā)保持高抑制率；② 茶多酚在低濃度0.05 g／L下，能夠輕度延緩孢子的萌發(fā)，與0.1 g／L時促進(jìn)萌發(fā)效果相反，這與茶多酚對灰葡萄孢菌絲的抑制效果類似，其對孢子萌發(fā)的抑制或促進(jìn)與其濃度有關(guān)；③ 植酸在EC50濃度下，幾乎不影響孢子萌發(fā)，失去了EC90時的高抑制率；④ 苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉高低兩濃度對孢子萌發(fā)影響較弱，EC50時可以少許提高萌發(fā)速度；⑤ 雙乙酸鈉EC50時延緩孢子萌發(fā)速度比EC90強。

2.3.3 比較幾種抑制劑對菌絲和孢子抑制力的區(qū)別 由表4可知，在EC50和EC90濃度下，納他霉素均能完全抑制灰葡萄孢孢子的萌發(fā)，其抑制效果甚至高于其對于菌絲生長的抑制，說明其抑菌能力偏向于對孢子萌發(fā)的抑制，這與張鵬的結(jié)論一致［9］。山梨酸鉀的抑制能力稍弱于納他霉素。其它抑菌劑僅能適當(dāng)降低孢子萌發(fā)速度，不能改變最終孢子萌發(fā)率。

圖2 不同抑菌劑EC 50和EC 90濃度下孢子萌發(fā)曲線（21℃）Figure 2 Spore germination curvefor different antimicrobial agents at the concentrations of EC 50 and EC 90（21 ℃）

除納他霉素，其它抑菌劑對孢子萌發(fā)的抑制要遠(yuǎn)不如其對于菌絲生長的抑制。這與文獻(xiàn)［10］結(jié)果一致，抑制孢子萌發(fā)的MIC濃度一般要5～10倍于抑制菌絲生長的MIC濃度，因為真菌孢子萌發(fā)受生長環(huán)境影響程度較小，而生長環(huán)境對于菌絲生長的影響則較大。

3 結(jié)論

由于植物病原真菌的侵染過程比較復(fù)雜，孢子的萌發(fā)和菌絲的生長這兩個環(huán)節(jié)都會影響病害的發(fā)病速度和嚴(yán)重程度，因此在篩選防治藥物的時候，不僅需要控制菌絲生長，也要限制孢子的萌發(fā)。

對于番茄采后灰霉病病原的離體抑菌試驗，結(jié)果表明：納他霉素和脫氫乙酸鈉對灰葡萄孢M(jìn)IC和抑制中濃度最低，敏感性最強；納他霉素和山梨酸鉀在EC50和EC90濃度下，對灰葡萄孢孢子萌發(fā)具有較強的抑制作用，但山梨酸鉀濃度偏大。

綜合以上試驗，對幾種抑菌劑敏感性進(jìn)行比較后表明（表5），在番茄采后灰霉病的防治過程可以使用納他霉素、脫氫乙酸鈉和山梨酸鉀輪換或混配使用，可以達(dá)到經(jīng)濟有效的綜合防治效果。但在實際采后病害防治中，由于病原物、寄主和貯藏環(huán)境之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，并且抑菌劑的使用濃度和方法對防治效果也有一定影響，這些需要后續(xù)試驗加以研究。

表5 灰葡萄孢對幾種抑菌劑的敏感性總結(jié)Table 5 Summary on sensitivity of Botrytis cinereato several antimicrobial agents

1 賴傳雅，袁高慶.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］.北京：國家科學(xué)出版社，2008：222～223.

2 張紅印，蔣益虹，鄭曉冬，等.酵母菌對果蔬采后病害防治的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2003（4）：23～25.

3 Fan Q，Tian S P.Postharvest biological control of grey mold and blue mold on apple by Cryptococcus albidus（S aito）Skinner［J］.Postharvest Biology and Technology，2001，21（3）：341～350.

4 趙妍.拮抗酵母及結(jié)合熱空氣處理對櫻桃番茄采后病害的防治及其機理研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

5 習(xí)柳，田世平.酵母拮抗菌與碳酸氫鈉配合對番茄果實采后病害的防治效果研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（5）：950～954.

6 崔志峰，丁貞科，馮貽安，等.灰葡萄孢產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)條件［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008（6）：441～445.

7 黃昌華.用瓊脂玻片法測定孢子萌發(fā)率［J］.植物保護(hù)，1993（3）：36～37.

8 臧睿，黃麗麗.蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)及其影響條件研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007（1）：64～67.

9 張鵬.納他霉素對灰葡萄孢的活性及作用機理研究［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

10 劉霞，楊克強，姜興印，等.危害核桃的鏈格孢（Alternariaalternata）對4種殺菌劑的敏感性［J］.農(nóng)藥，2013（1）：68～70.