禽流感病毒進化研究進展

摘 要：禽流感是禽流行性感冒的簡稱，是由正黏病毒科中的A型流感病毒亞型引起的禽類傳染性疾病，被國際獸疫局定為A類傳染病。不僅是雞，其它一些家禽和野鳥都能感染禽流感。禽流感流感病毒，它是一種有包膜、單股負鏈、分節(jié)段RNA病毒。共分為8個節(jié)段，其中與抗原變異關(guān)系密切的是HA、NA。流感病毒主要通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換來逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊。由點突變造成的抗原漂移可導(dǎo)致流感每年的季節(jié)性流行，而抗原變異造成的抗原轉(zhuǎn)換則可能產(chǎn)生新的亞型。本文通過對禽流感病毒基因組研究，禽流感病毒跨種屬感染概況和變異機制等方面做一下綜述，從而可以更好認識禽流感病毒和防止禽流感爆發(fā)。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒基因組；跨種屬感染；抗原變異；基因重組

中圖分類號：S855 文獻標識碼： A 文章編號：1001-0769（2014）08-0046-03

1 禽流感病毒基因組構(gòu)成及病毒變異的分子基礎(chǔ)

禽流感病毒是有包膜的RNA病毒，屬于正粘病毒科，外觀形態(tài)為直徑80 nm～120 nm的球狀或長達數(shù)千納米的絲狀。依據(jù)其核蛋白NP抗原性的差異分為A、B、C三型，而依其外膜血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA的不同，目前可分為16個H亞型和9個N亞型，不同型別和亞型在基因組結(jié)構(gòu)、多肽構(gòu)成、感染性和致病性等方面存在差別[1]。迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的A型流感病毒的16個H亞型和9個N亞型均可以從禽類分離到。AIV的基因組由8條單股負鏈RNA組成，共編碼10種蛋白（PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2），每一條RNA都以不同的核糖核酸蛋白復(fù)合體形式存在[2]。所有基因片段的5'端的13個核苷酸高度保守，其序列為：GGAACAAAGUGAppp5'，3'端也有12個高度保守的核苷酸，序列為：3'HO-UCGUUUUCGUCC，在每一片段靠近5'端15～21核苷酸處有一保守區(qū)，起序列為PolyU。這一保守區(qū)在病毒mRNA合成時產(chǎn)生PolyA的信號[3]。流感病毒的血凝素HA是主要的表面抗原，為75 K糖蛋白，由病毒的RNA4片段編碼，成熟的HA是由三個HA單體分子通過二硫鍵連接并折疊成一定形狀而成，可分為兩部分，一部分是球狀的頭部，含有受體結(jié)合位點和抗原決定簇；另一部分為柄，與囊膜相連。HA在宿主蛋白酶的作用下裂解成HA1和HA2，從而具有感染性。這在不同的宿主細胞是不同的，因此，HA對細胞蛋白酶的易感性和這些酶在宿主組織里的分布是病毒泛嗜性的決定因素。HA具有亞型特異性，是誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，是病毒變異、毒力和宿主特異性的主要決定因素[4]。最近的研究表明，禽流感和人流感的毒力機制稍有不同，禽流感的毒力機制是HA對泛嗜性融合素和PC6蛋白酶的易感性決定病毒的泛嗜性，而人類流感病毒則通過胞漿素對HA的裂解來獲得泛嗜性[5]。HA能夠特異性地吸附紅細胞表面的唾液酸糖蛋白受體，引起紅細胞凝集，與病毒的吸附，膜融合，還有病毒毒力有直接關(guān)系，是病毒主要的免疫保護基因[6]。神經(jīng)氨酸酶NA由RNA6編碼，是另一個主要的表面抗原，囊膜上的NA纖突是NA單體形成的四聚體，它包括一個盒子狀的頭部和一個細莖。NA可裂解唾液酸和附近的糖殘基之間的A糖苷鍵，使子代病毒釋放出來，還可防止病毒之間的聚集，這一功能對病毒粒子的釋放以及防止病毒粒子聚集很重要。NA不直接參與病毒的裝配和出芽，但與病毒的宿主特異性和病毒的毒力有關(guān)[7]。核蛋白NP核蛋白是由RNA5編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，主要功能是使vRNA形成RNP復(fù)合體，穩(wěn)定vRNA免受RNAase作用并在病毒的基因表達和復(fù)制中起一定作用[8]?；|(zhì)蛋白M由病毒基因組RNA7編碼，是病毒粒子中含量最高的蛋白。有2個讀碼框，可翻譯出2種蛋白質(zhì)M1和M2，M1是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，形成核衣殼，在病毒粒子的裝配過程中起重要作用，M2其氨基酸序列很保守，在同源性高達90 %，具有離子通道的作用，故稱為離子通道蛋白，主要通過質(zhì)子H+，也允許Na+通過，低pH可以激活其活性，金鋼脘則抑制其活性。流感病毒的聚合酶由3種成分組成：PB1、PB2、PA。這3種蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有一共同特點，都含有一特異的親核區(qū)，使其在胞漿中合成后能順利進入細胞核。A型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白由RNA8編碼，有2個讀碼框，可產(chǎn)生2種蛋白質(zhì)NS1和NS2這兩種蛋白質(zhì)大量存在于感染的細胞中，NS1主要在核內(nèi)，NS2主要在胞質(zhì)。其中與禽流感變異的相關(guān)的主要基因有HA、NA及M基因，應(yīng)該予以重視[9]。

2 AIV跨種屬屏障感染

2.1 禽流感病毒跨種屬屏障感染的影響因素

流感病毒的傳播有一定的宿主限制性，例如從人體內(nèi)分離到的主要是H1、H2和H3亞型，在1997年特別是2003～2005年才分離到H5亞型病毒。禽流感病毒不能有效地在人或非人靈長目動物體內(nèi)有效地復(fù)制[10]，它的宿主范圍是由許多因素決定的，其中病毒血凝素H起重要作用。H負責識別靶細胞表面受體并與之結(jié)合，因此，宿主細H受體結(jié)合位點（Receptor Binding Site，RBS）的結(jié)構(gòu)，就成了決定流感病毒宿主特異性的主要因素。A型流感病毒的受體是位于細胞膜上的唾液酸糖脂或唾液酸糖蛋白，在人是唾液酸α-2，3半乳糖的寡糖，在禽和馬是唾液酸α-2，3半乳糖的寡糖；而豬的氣管黏膜上皮細胞膜同時含有唾液酸α-2，6半乳糖寡糖和唾液酸α-2，3半乳糖寡糖[11]。這初步解釋了人、禽和豬流感病毒何以能在豬體內(nèi)共同感染、復(fù)制及重排，使豬充當病毒“混合器”角色的原因。H受體特異性是決定某病毒株能否感染人，并在人群中傳播開來的重要因素之一。Matrosovich對1997年香港H5N1亞型的研究發(fā)現(xiàn)，它們優(yōu)先結(jié)合唾液酸α-2，3半乳糖，而不是唾液酸α-2，6半乳糖，這可以部分地解釋H5N1亞型病毒沒有在人群中普遍傳播開來的原因。然而，近幾年人禽流感病例明顯增多，是否意味著H5N1亞型開始突破禽與人的種間屏障？如果真的是這樣，一旦H5N1亞型又獲得了在人與人間傳播的能力，那后果就不堪設(shè)想了。

2.2 跨種屬感染流行概況

2.2.1野生禽類流感病毒感染家禽

以往研究認為，AIV在野禽中會比較穩(wěn)定存在，然而近幾年的禽流感流行趨勢卻打破了這一傳統(tǒng)觀點。對2000年和2001年哥倫比亞雞H6N2病毒的研究表明，該病毒已開始在雞中獨立傳播，Campitelli等對意大利2001年H7N3野鴨毒株與2002～2003年期間火雞毒株的表面抗原和基因型特征進行比較，發(fā)現(xiàn)火雞H7N3毒株是來源于一年前的野生水禽類，證明AIV可以從野生禽類病毒庫中傳播到家禽類，然而在家禽中卻分離不出最原始的毒株[12]。

2.2.2 AIV跨種屬直接感染人

2009年北京、山西、山東各確診一例人禽流感病例。北京報告的病例生前曾在活禽攤位購買過活鴨，并曾清洗鴨內(nèi)臟。而據(jù)舒躍龍介紹，山西患兒病例的姑姑在活禽市場做生意，患者發(fā)病前曾多次隨家人去過活禽市場，存在暴露史。山東禽流感致死患者生前以賣麻辣燙為生?，F(xiàn)在來看，禽流感病毒H5N1在傳播途徑上仍以禽傳人為主，直接接觸病死禽是最常見的危險因素，食用未經(jīng)深加工的禽類制品也有潛在危險，對于很多病例而言，訪問活禽市場是唯一發(fā)現(xiàn)的危險因素。由此可見，AIV在人群中傳播途徑不斷地發(fā)生變化，為了更加適應(yīng)新的宿主人，病毒在不斷發(fā)生變異[13]。

2.2.3 其他哺乳類動物受感染

2004年10月，在泰國高致病性AIV（HPAI）H5N1感染了老虎，造成45只死亡。除了感染人之外，H5N1病毒可跨越種屬屏障感染以下哺乳動物，如猴、鼠、豬、雪貂、家貓、虎和美洲豹?？梢夾IV已在家禽中穩(wěn)定存在，并以其作為中間宿主，將病毒傳播給人或其它哺乳類動物[14]。

2.2.4 人-人傳播的可能

2004年9月，泰國一個女孩因感染H5N1病毒而死亡，其母親雖無接觸家禽史，但在照顧患兒后也因感染H5N1病毒而死亡；這提示患兒可能直接將病毒傳染給母親。人-人傳播AIV的病例在此之前可能已發(fā)生，例如：香港一名健康護理中心的工作人員被感染；越南禽流感爆發(fā)時的家庭聚集現(xiàn)象等；荷蘭一位家禽場工人的女兒感染了H7N7病毒引起結(jié)膜炎等。AIV一旦獲得人-人傳播的能力，新流感亞型如H5N1病毒對人類健康的威脅就大大增強了[15]。

3 禽流感病毒變異的類型及機制

3.1 病毒進化機制

3.1.1 基因突變是其進化和突變的基礎(chǔ)

病毒的復(fù)制每日數(shù)以億計，RNA（核糖核酸）病毒轉(zhuǎn)錄酶不具有校對功能其錯配率在十萬分之一到萬分之一，遠高于宿主細胞[16]。由于DNA（脫氧核糖核酸）病毒聚合酶有糾錯功能，其突變率遠低于RNA病毒，但也大大超過宿主細胞。高速的復(fù)制及高度的突變率增加了病毒的基因多樣性，為其突變和進化提供了首要條件。點突變通常發(fā)生在密碼子第三個核苷酸，多是一種無表型突變（nonphenotypic mutation），而發(fā)生在密碼子第一、二個核苷酸的突變，可能引起氨基酸的改變在關(guān)鍵位置上核苷酸的突變造成的錯義突變（missense muttion），可影響病毒的復(fù)制和病毒蛋白的表達。如果該處核苷酸分別參與重疊的開放讀碼框，則單一位點的突變可改變個開放讀碼框。

3.1.2 基因交換加快病毒的進化

病毒之間可以通過基因組片段的重組（recombination）或重配（reassortment）交換遺傳信息，這是病毒在自然選擇過程中繼續(xù)生存所必需的。兩種或多種病毒同時感染一個宿主細胞為病毒之間遺傳信息的交換提供了機會[17]。此外，病毒與細胞基因組之間也存在遺傳信息的交換，許多病毒基因組中都存在與宿主高度同源的序列就是最好的證明。這種遺傳信息的交換在病毒進化中扮演了一個的重要角色。

3.1.3 自然選擇

能存在與自然界的完整病毒必須總是先于宿主進行適者生存的選擇。病毒進化一般具有兩條途徑，一是病毒與宿主共同進化，兩者具有相同的命運，二是病毒選擇多種宿主，從而具有廣闊的生存空間。一般RNA病毒選擇第二條途徑[18]。

3.2 禽流感病毒進化

Rubing Chen等人研究了流感病毒進化的動力學(xué)，對A型流感病毒的核酸取代做了一下評估，研究顯示，取代的數(shù)率>10-3每個位點每年，家禽，野生禽的差異性不大[19]?？乖宰儺愂茿IV常見的一種自然變異。AIV不停地改變其抗原性，主要是為了逃脫宿主已獲得的免疫。根據(jù)抗原性變異的程度可分為2種：抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變。

3.2.1 抗原漂移

抗原的漂移是由編碼HA或NA蛋白的基因發(fā)生點突變，當氨基酸的改變積累到一定程度或突變氨基酸正好使抗原決定簇發(fā)生改變，則引起抗原性的變異。點變化是由于RNA依賴的聚合酶復(fù)合體缺乏校讀能力而引起。刪除型突變經(jīng)常是由復(fù)制復(fù)合體提前終止或不時在模板上沿著讀碼框或另一模板的開始而產(chǎn)生。插入型突變以類似的方法發(fā)生，主要是由于復(fù)制復(fù)合體在已讀過的序列上重新開始而引起。突變主要是發(fā)生在A型流感上第四節(jié)段抗原性明顯的血凝素HA基因上。抗原漂移是由HA或NA基因發(fā)生點突變引起的。HA或NA次要抗原的變化，其中HA基因的變異率最高，每個核苷酸在每個復(fù)制周期中的變異率可高達2×10-3，即病毒每復(fù)制一代，HA基因上大約有1個堿基發(fā)生變異。針對于HA和NA的免疫壓力（抗體的壓力篩選）是抗原漂移的主要原因，近年來由于免疫系統(tǒng)對病毒變異的壓力增加使AIV變異率提高[20]?？乖剖橇鞲腥炕蚱巫兓姆e蓄，此變化對經(jīng)常受到宿主防御機制選擇壓力的表面糖蛋白尤為重要。在基因重組的新亞型A型流感病毒大流行之后，RNA各個節(jié)段的點突變逐漸積累，開始產(chǎn)生抗原性漂移。編碼HA的基因突變往往改變H的抗原性，當針對先前流行株的抗體不再能中和現(xiàn)時流行株時，即意味著出現(xiàn)了新的毒株。H的改變集中在其分子與抗原性有關(guān)的5個區(qū)，某個重要抗原位點的單個氨基酸的改變也能改變其與抗體結(jié)合的能力，不過人及禽的毒株的H蛋白的某些區(qū)域是保守的。

3.2.2 抗原轉(zhuǎn)變

抗原轉(zhuǎn)變是HA或NA主要抗原的變化。AIV基因組由8個負鏈的單鏈RNA片段組成，當同一細胞同時感染兩種不同的流感病毒時，有可能產(chǎn)生256種新的重組病毒，從而產(chǎn)生抗原轉(zhuǎn)變[21]。易感動物的種類和病毒的致病力也隨之改變。在很少發(fā)生、而且不可預(yù)測的間隔期內(nèi)，現(xiàn)行的流感病毒亞型不見了，又出現(xiàn)了1個或2個表面糖蛋白（HA，NA）已替換的新亞型病毒針對先前流行株的抗體與新的毒株沒有交叉反應(yīng)起不到抗病作用，流感則又一次暴發(fā)了。病毒遺傳組成的變化如此之大，使目前流行的病毒變化成新病毒的機會大大增加?？乖缘钠冞€可能引起不同的A型流感病毒重組成新病毒。在兩種病毒共同感染的細胞中，因為病毒復(fù)制和裝配的不忠實性，重組成包括混合遺傳材料的病毒的機會甚大。另外包括全部8基因片段的流感病毒活下來的機會比帶不完全的片段的機會要大。豬是人和動物的病毒混合器。源于禽類A型流感病毒在人體很難增殖，反之亦然。但是二者均能在豬體內(nèi)增殖，每隔10～20年就會在豬體出現(xiàn)一個重配的A型流感毒株，它具有能編碼在人體復(fù)制功能的基因及禽的H基因。

3.2.3 基因重排

A型流感病毒是分節(jié)段、單股負連RNA病毒，有8個基因片段，當2個或2個以上的不同病毒粒子同時感染一個宿主細胞時，在病毒的增殖過程中，不同毒粒子的8個基因組片段可以隨機相互交換，從而發(fā)生核酸片段水平上的重新組合，理論上通過基因片段的重排有可能產(chǎn)生256種遺傳不同的子代病毒。在自然界，這種混合感染的現(xiàn)象常見，據(jù)Mark J. Gibbs、Adrian J. Gibbs等研究1918年西班牙流感就是由人流感與禽流感重組的結(jié)果[22]。同時，流感病毒的進化與自然選擇也是密切相關(guān)的，Magdalena Escorcia[23]研究，由于近年來疫苗的大量使用，在疫苗的選擇壓力下，流感病毒也頻繁的變異，來逃避疫苗的作用。

3.2.4 禽流感病毒抗原變異引起的效應(yīng)

HPAIV的毒力是由多個基因決定的，H起決定性作用。H基因的表達產(chǎn)物血凝素即H，可介導(dǎo)病毒結(jié)合到細胞受體上；但未經(jīng)水解的H即H0，僅能識別宿主細胞表面受體，但卻不能與宿主細胞膜發(fā)生融合，還不具有感染性。H的裂解是由宿主細胞的蛋白酶完成的，蛋白酶在組織中的不同分布和H這些酶的敏感性決定了病毒組織嗜性和感染能否發(fā)生。H經(jīng)過切割加工裂解為H1和H2兩個亞單位，H2的NH2-末端介導(dǎo)病毒囊膜和宿主細胞膜融合，并且促使病毒核糖核蛋白復(fù)合體釋放出來，從而激發(fā)病毒的感染。H的裂解性決定于2個因素，一是裂解位點處的氨基酸序列，二是裂解位點附近氨基酸的糖基化。Bosch等比較了LPAIV和HPAIV的H氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)二者在H裂解位點處的氨基酸序列不同。LPAIV的H裂解位點處只有單個的堿性氨基酸，故只能在呼吸道、消化道等少數(shù)細胞中裂解，造成溫和感染，甚至不表現(xiàn)臨床癥狀；而HPAIV的H裂解位點處有多個連續(xù)的堿性氨基酸插入，在無類胰蛋白酶的情況下也可發(fā)生裂解，因此可在宿主很多不同細胞中裂解為H1和H2，造成感染禽全身各系統(tǒng)發(fā)生衰竭，導(dǎo)致死亡。另外，切割位點附近氨基酸糖鏈的丟失能使H對蛋白酶變得更敏感，從而使得病毒的致病力增高。因為糖鏈可干擾蛋白酶到達裂解位點，當除去糖鏈后，可提高H對蛋白酶的敏感性。N也與毒力有關(guān)。有實驗證明，N的C末端是一個賴氨酸Lys時，容易結(jié)合纖溶酶原（plasmino-gen），它隨即變?yōu)槔w溶酶（plasmin）而直接參與H的裂解。當N的C末端賴氨酸發(fā)生改變時，則喪失結(jié)合纖溶酶原的能力及H的裂解性[24]。除了H和N外，HPAIV的毒力與M（基質(zhì)蛋白）有關(guān)[25]。實驗表明，病毒M蛋白與插入細胞脂質(zhì)雙層的H2的C末端發(fā)生作用，這有助于病毒建立感染。HPAIV分子致病機理的深入研究有重要的基礎(chǔ)理論意義。

禽流感病毒具備很強的變異能力，因此隨時都可能出現(xiàn)能夠在人與人之間傳播的病毒變種。應(yīng)及時采取措施防止高致病性禽流感病毒從水禽及野禽傳染給雞或者哺乳動物。野禽、遷棲禽類大規(guī)模飼養(yǎng)的家禽中感染一種以上AIV時，在當代高密度飼養(yǎng)的商品禽群中會選出具有更強致病性的病毒型。這使得對禽流感的防治更加艱難。目前中國禽流感疫苗的生產(chǎn)工藝已非常成熟，應(yīng)盡快建立一個比較系統(tǒng)、全面和完整的禽流感病毒庫。建立完整的禽流感病毒庫，目的是對禽流感病毒的人畜共患機理進行解析，對禽流感病毒分子進化機制及該病毒跨種屬的傳播機制進行分析、研究，為研制新型、有效的人用和禽用禽流感疫苗奠定基礎(chǔ)?！酢?/p>

參考文獻：（25篇，略）