紅曲霉液體深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素條件的研究

李慧 蘭時樂

（1.湖南省微生物研究院,湖南長沙410009；2.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）お

摘要

［目的］ 確定紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素最適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。［方法］ 采用改變單一變量的方法，測定紅色素色價的變化規(guī)律，確定紅曲霉產(chǎn)生紅色素最適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。［結果］試驗確定了紅曲霉產(chǎn)生紅色素最適宜的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖5%，酵母粉2%，CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4·7H2O 0.1% ，KH2PO4 0.2%，吐溫20 0.05%;最適宜的培養(yǎng)條件為：pH 6.0，裝液量為60 ﹎l/250 ml三角瓶中接種10%(1/6)種齡為72 h的液體種子， 30 ℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，轉速為180 r/min，發(fā)酵6 d，紅曲色素色價可達19.2 U/ml。［結論］該試驗可為工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)紅曲紅色素提供理論依據(jù)。

關鍵詞 紅曲霉；紅色素；液態(tài)發(fā)酵；發(fā)酵條件

中圖分類號 SB188+.4文獻標識碼

A文章編號 0517-6611（2014）19-06360-04お

Study on Liquid Fermentation Conditions of 玀onascus 玃igment by 玀onascus fumeusお

LI Hui, LAN Shi瞝e (Microbiology Institute of Hunan Province, Changsha, Hunan 410009; School of Biology Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128)

Abstract［Objective］ To determine the optimal culture medium and fermentation conditions of 玀onascus 玴igment production by 玀onascus fumeus. ［Method］ By changing single variable, the variation law ofred pigment was determined, the optimal culture medium formula was determined. ［Result］ The optimal culture medium was as follows: glucose 5%, yeast powder 2%, CaCO3 0.2%, NaCl 0.1%, MgSO4·7H2O 0.1%, KH2PO4 0.2%, Tween 20 0.05%. The suitable fermentation conditions were as follows: pH 6.0, broth volume of the shake flake 60 ﹎l/250 ml, inoculation volume 10%(1/6), seed瞐ge 72 h, culture temperature 30 ℃, rotation speed 180 r/min, fermentation time 6 d, the 玀onascus 玴igment reached 19.2 U/ml. ［Conclusion］ The study can provide theoretical basis for the large scale production of 玀onascus 玴igment.

Key wordsMonascus 玈pp.; Erythrophyll; Liquid state fermentation; Fermentation conditions

お

作者簡介 李慧（1969- ），女，湖北武漢人，工程師，從事微生物資源利用研究。*通訊作者，副教授，碩士，碩士生導師，從事生物工程研究。

收稿日期 20140529

最遲在1 000年以前，我國的先民就已發(fā)明了紅曲［1］。紅曲霉(Monascus)用途很多，我國早在明朝就利用它培制紅曲，紅曲可用于釀酒、制醋、做豆腐乳的著色劑，并可作食品染色劑和調(diào)味劑，還可做中藥，近年來紅曲霉已用于工業(yè)生產(chǎn)糖化酶制劑。紅曲霉在歐洲一度被視為一種腐敗菌，但在許多亞洲國家，特別是東南亞則被用來作為加工傳統(tǒng)食品的微生物［2］。

紅曲霉在生長過程中能產(chǎn)生多種酶，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶、果膠酶等，不同種類菌株產(chǎn)酶的類型及產(chǎn)量有所差異，某些菌種能分泌直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶，有的紅曲霉菌株還能產(chǎn)較高活性的蛋白酶，故可用紅曲腌漬魚、肉、豆腐等高蛋白食品，經(jīng)1～3個月的腌漬，可制出色、香、味具佳的產(chǎn)品。紅曲中含有葡萄糖淀粉酶能將淀粉幾乎百分之百地水解成葡萄糖，工業(yè)上利用紅曲這一特性代替了酸水解法生產(chǎn)葡萄糖。

2002年我國規(guī)定,允許食品加工使用的紅色食用色素主要有甜菜紅、胭脂紅和紅曲紅等［3］。在國外，甜菜紅和胭脂紅已經(jīng)被禁止使用和限制使用［4］，而紅曲紅色素以糧食為原料，可通過發(fā)酵法大量生產(chǎn)，可以滿足常年大規(guī)模生產(chǎn)的需要，而且紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物本身具有較好的營養(yǎng)價值和一定的防腐作用［5-7］，具有降低血脂、降血壓、抑瘤抗癌、提高人體免疫力等藥用功效［8-10］，長期使用對人體有益無害。因此，目前紅曲已廣泛用于食品添加劑、降血脂藥物及保健食品等方面［11］。

紅曲霉是一種腐生真菌,它屬于真菌門、子囊菌綱、真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科和紅曲霉屬。紅曲霉的利用在我國具有悠久的歷史［12］，長期以來，人們對紅曲霉的關注集中在其產(chǎn)生大量的天然紅曲色素方面，并且將研究重點放在了紅曲色素著色劑的生產(chǎn)及其在釀酒、釀醋、制成腐乳、腌漬肉類等應用方面［13］。最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)紅曲霉在生長過程中可以產(chǎn)生色素、抗生菌、桔霉素等多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物有著不同的生物學活性，其中一些具有顯著的醫(yī)療價值。20世紀80年代以來，國內(nèi)外對具有周期發(fā)酵短、發(fā)酵過程易控制、節(jié)省原材料、色素含量高、雜質少等諸多優(yōu)點的液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲色素進行了較為深入的研究，取得了很大的進展，發(fā)酵的色價達到了較高的水平［14-15］。

液體發(fā)酵培養(yǎng)法是生產(chǎn)紅曲紅色素較為理想的方法，具有工藝簡單、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，不過該方法色素產(chǎn)率低，影響推廣。紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的變化對所產(chǎn)生色素的種類、性質和質量會有很大影響［16-19］。因此，液體發(fā)酵法生產(chǎn)紅色素的關鍵是篩選高色價的紅曲霉色素的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。紅曲霉（玀onascus spp.）,湖南省微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，豆餅粉1%，氯化銨1%，CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.2%，pH自然。發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：大米粉 8.0%，豆餅粉 2.0%，KH2PO4 0.2%, MgSO4·7H2O 0.1%,CaCO30.2%,NaCl 0.1%，pH自然。

1.1.3 主要儀器設備。SS325自動立式滅菌鍋；ZD85氣浴恒溫振蕩器，常州市華益達教學儀器有限公司；DHG9076A電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP9082型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；721分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；SW睠J1FD超凈工作臺。

1.1.4 主要試劑與藥品。大米粉，糯米粉，淀粉，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，豆餅粉，酵母粉，魚粉，蛋白胨，硫酸銨，氯化銨，KH2PO4，K2HPO4，Na2HPO4，NaH2PO4,吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，洗衣粉，MgSO4·7H2O，CaCO3，NaCl，HCl緩沖液，NaOH緩沖液，瓊脂，馬鈴薯，pH試紙，燈用酒精。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。斜面培養(yǎng)：將接種好的斜面置于30 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)6 d。液體種子培養(yǎng)：將接種的液體種子培養(yǎng)基置于恒溫搖床上，轉速為180 r/min，于30 ℃培養(yǎng)48 h。液體發(fā)酵培養(yǎng)：在250 ml三角瓶中裝入100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%的接種量接種后于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。

1.2.2

紅曲色素發(fā)酵條件的研究。通過對碳源、氮源、無機鹽、表面活性劑、裝液量、pH、培養(yǎng)溫度、接種量、種齡、轉速、培養(yǎng)時間等因素的選擇來優(yōu)化紅曲霉紅曲色素產(chǎn)生的條件。

1.3 紅曲色素的測定

按照文獻［20］提供的方法測定。將發(fā)酵液用4層紗布過濾，所得濾液稀釋20倍后，用蒸餾水作為對照，在510 nm波長下測定吸光度。用吸光度乘以發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)，即為發(fā)酵液的色價（U/ml）［21］。

發(fā)酵液色價＝吸光度玂D值×稀釋倍數(shù)

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)量的影響

2.1.1 不同碳源對紅曲色素生成的影響。改變基礎培養(yǎng)基中碳源的種類，以大米粉、糯米粉、淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源，加入量為8%，其他條件不變，考察不同碳源對紅曲色素產(chǎn)生的影響。從表1可以看出，不同碳源發(fā)酵產(chǎn)生的紅色素色價各有不同，其中以麥芽糖和葡萄糖最好，淀粉最差。主要因為淀粉成糊狀，影響培養(yǎng)基中溶氧，不利于菌體的生長。麥芽糖比葡萄糖稍好，基于生產(chǎn)成本考慮，選用葡萄糖作為碳源較為適宜。

表1 碳源對紅曲色素產(chǎn)生的影響

碳源 玂D值 色價∥U/ml

大米粉 0.20 4.00

糯米粉 0.33 6.60

淀粉 0.08 0.16

葡萄糖 0.42 8.40

蔗糖 0.22 4.40

麥芽糖 0.43 8.60

2.1.2 葡萄糖含量對紅曲色素生成的影響。

在其他條件不變的條件下，以4%、5%、6%、7%、8%、9%的葡萄糖為碳源，考察葡萄糖濃度對發(fā)酵液紅曲霉紅曲色素色價的影響。

從表2中可以看出，葡萄糖4%～5%時，隨著葡萄糖用量的增加，紅曲色素色價增大，到達5%以后，隨著葡萄糖用量的增加，紅色素色價減小，但是速度不快，并沒有明顯的差異。所以，該菌種碳源的最適的量為5%。

表2 葡萄糖含量對紅曲色素產(chǎn)生的影響

葡萄糖∥% 玂D值 色價∥U/ml

4 0.46 9.2

5 0.52 10.4

6 0.50 10.0

7 0.39 7.8

8 0.40 8.0

9 0.39 7.8

10 0.37 7.6

2.1.3 不同氮源對紅曲色素生成的影響。在其他條件不變的條件下，以熟豆餅粉、酵母粉、魚粉、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨各2%為氮源，考察對發(fā)酵液紅曲霉紅曲色素色價的影響。

從表3可以看出，不同氮源發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素色價差異較大，無機氮源發(fā)酵產(chǎn)生紅曲色素明顯較有機氮源發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素色價低。當使用酵母粉為氮源時，紅曲色素色價可達19.20 U/ ml。

表3 氮源對紅曲色素產(chǎn)生的影響

氮源 玂D值 色價∥U/ml

豆餅粉 0.44 8.80

酵母粉 0.94 19.20

魚粉 0.33 6.60

蛋白胨 0.37 7.40

硫酸銨 0.02 0.40

氯化銨 0.07 0.14

2.1.4 酵母粉含量對紅曲色素生成的影響。

改變培養(yǎng)基中酵母粉的含量，其他條件不變，分別考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的酵母粉對紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素的影響。

從表4可以看出，酵母粉含量0.5%～4.0%時，隨著酵母粉的增加，紅色素色價逐漸增大，當酵母粉含量為2.0%時，發(fā)酵液色價達17.0 U/ml，但酵母粉含量超過2.0%，發(fā)酵液色價明顯降低。

表4 酵母粉含量對紅曲色素產(chǎn)生的影響

酵母粉∥% 玂D值 色價∥U/ml

0.5 0.42 8.4

1.0 0.65 13.0

1.5 0.72 14.4

2.0 0.85 17.0

2.5 0.80 16.0

3.0 0.72 14.4

3.5 0.69 13.8

4.0 0.60 12.0

2.1.5 磷酸鹽對紅曲色素生成的影響。

改變培養(yǎng)基中磷酸鹽的種類，其他條件不變，分別考察KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO44種不同的磷酸鹽對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)生的影響。

從表5可以看出，不同無機鹽發(fā)酵產(chǎn)生的紅色素色價各有不同，其中KH2PO4和Na2HPO4比K2HPO4和NaH2PO4發(fā)酵產(chǎn)生的紅色素色價要高，Na2HPO4最好，但KH2PO4成本較低，且發(fā)酵產(chǎn)生的紅色素色價較高，和Na2HPO4差異不明顯。從原材料的來源及貯存等方面考慮，選用KH2PO4為發(fā)酵的磷源。

表5 磷酸鹽對紅曲色素產(chǎn)生的影響

磷酸鹽 玂D值 色價∥U/ml

KH2PO4 0.72 14.4

K2HPO4 0.55 11.0

Na2HPO4 0.74 14.8

NaH2PO4 0.61 12.2

2.1.6 表面活性劑對紅曲色素生成的影響。

表面活性劑可改變細胞膜的通透性，使代謝產(chǎn)物從細胞中釋放出來，從而降低代謝產(chǎn)物對代謝途徑的阻遏作用。改變培養(yǎng)基中表面活性劑的種類，考察吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80及洗衣粉等表面活性劑對紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素的影響。

從表6可以看出，吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素色價差異不大，但其紅曲色素明顯高于洗衣粉。當使用吐溫20作為表面活性劑時，發(fā)酵液色價可達14.4 U/ml。

表6 表面活性劑對紅曲色素生成的影響

表面活性劑 玂D值 色價∥U/ml

吐溫20 0.72 14.4

吐溫40 0.70 14.0

吐溫60 0.67 13.4

吐溫80 0.69 13.8

洗衣粉 0.53 10.6

2.1.7 吐溫20用量對紅曲色素生成的影響。

改變吐溫20用量，分別考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的吐溫20對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)生的影響。

從表7可以看出，吐溫20在0.05%～2.50%發(fā)酵產(chǎn)生的紅色素色價逐漸減小，所以，0.05%的吐溫20是最適合的表面活性劑的量。

表7 吐溫20用量對紅曲色素生成的影響

吐溫20∥% 玂D值 色價∥U/ml

0.05 0.72 14.4

0.10 0.65 13.0

0.15 0.60 12.0

0.20 0.54 11.8

0.25 0.50 10.0

2.2 培養(yǎng)條件對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)量的影響

2.2.1 溫度對紅曲色素生成的影響。

分別在26、28、30、32、34、36 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，其他條件不變，測定其發(fā)酵液的紅色素色價。

從表8可以看出，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，紅色素色價增大。當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，發(fā)酵液的色價最大；溫度超過30 ℃，發(fā)酵液的色價明顯降低。主要原因是因為溫度越高，不利于菌體生長，導致產(chǎn)色素量減少。

表8 溫度對紅曲色素生成的影響

溫度∥℃ 玂D值 色價∥U/ml

26 0.71 14.2

28 0.78 15.6

30 0.82 16.4

32 0.70 14.0

34 0.65 13.0

36 0.43 8.6

2.2.2 起始pH對紅曲色素生成的影響。

改變培養(yǎng)基的起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在其他條件不變的條件下，考察不同起始pH對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)量的影響。

從表9可以看出，培養(yǎng)基起始pH為6.0時，是紅曲霉合成和分泌紅曲色素適宜的pH。

表9 起始pH對紅曲色素生成的影響

起始pH 玂D值 色價∥U/ml

5.5 0.75 15.0

6.0 0.80 16.0

6.5 0.72 14.4

7.0 0.67 13.4

7.5 0.64 12.8

8.0 0.58 11.6

2.2.3 種齡對紅曲色素生成的影響。

改變接種種齡，其他條件不變，分別考察種齡為48、72、96 h對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)量的影響。從表10可以看出，在72 h時接種的種齡產(chǎn)生的紅色素色價最高。

表10 種齡對紅曲色素生成的影響

種齡∥h 玂D值 色價∥U/ml

48 0.54 10.8

72 0.57 11.4

96 0.48 9.6

2.2.4 接種量對紅曲色素生成的影響。

以4%、6%、8%、10%、12%、14%為接種量，其他成分不變，考察其對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)生量的影響。

從表11可以看出，隨著接種量的增加，紅色素色價逐漸增大，10%時達到最大值，之后隨著接種量的增加，紅曲色素色價逐漸減小。主要是因為接種量的增加，導致發(fā)酵的前期營養(yǎng)物質消耗過快，發(fā)酵液的黏度增加，從而影響菌絲體生長及色素的合成和分泌。

表11 接種量對紅曲色素生成的影響

接種量∥% 玂D值 色價∥U/ml

4 0.52 10.4

6 0.53 10.6

8 0.50 11.2

10 0.60 12.0

12 0.46 9.2

14 0.37 7.4

2.2.5 裝液量對紅曲色素生成的影響。

在250 ml三角瓶中分別裝50、60、70、80、90、100、110、120 ml發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同裝液量對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)量的影響。

從表12中可以看出，在裝液量為60 ml時，紅色素色價最高。這是因為紅曲霉是好氧菌，在營養(yǎng)充足的情況下，裝液量越少其通風量越大，溶氧量越多，有利于菌體生長代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生色素，因此選用60 ml裝液量為最佳。

表12 裝液量對紅曲色素生成的影響

裝液量∥ml 玂D值 色價∥U/ml

50 0.84 16.8

60 0.87 17.4

70 0.85 17.0

80 0.80 16.0

90 0.74 14.8

100 0.69 13.8

110 0.57 11.4

120 0.49 9.8

2.2.6 轉速對紅曲色素生成的影響。

在其他條件不變的情況下，分別考察140、160、180、200 r/min轉速對紅曲霉紅曲色素產(chǎn)生量的影響。

從表13可以看出，隨著轉速的增加，紅色素色價逐漸增大，180 r/min時達到最大值，之后隨著轉速的增加紅色素色價逐漸減小。因為轉速越大，有利于溶氧，從而有利于菌體生長，但是轉速過大，雖能增加溶氧量，但因機械損傷加大，從而導致生長的色素降低。

表13 轉速對紅曲色素生成的影響

轉速∥r/min 玂D值 色價∥U/ml

140 0.60 12.0

160 0.69 13.8

180 0.72 14.4

200 0.68 13.6

2.2.7 培養(yǎng)時間對紅曲色素生成的影響。

其他條件不變，培養(yǎng)3 d后，每隔24 h隨機取樣，直至7 d，測定發(fā)酵液紅曲色素色價。

從表14可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，紅色素色價逐漸增大，6 d時到達最大值，之后隨著培養(yǎng)時間的增加，紅色素色價逐漸減小。因此，適宜的培養(yǎng)時間為6 d。

表14 培養(yǎng)時間對紅曲色素生成的影響

培養(yǎng)時間∥d 玂D值 色價∥U/ml

3 0.47 9.4

4 0.52 10.4

5 0.59 11.8

6 0.61 12.2

7 0.56 11.2

3 結論與討論

通過研究,得到了紅曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素適宜的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖5%,酵母粉2%,CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4.7H2O 0.1% ,KH2PO4 0.2%,吐溫20 0.05%。適宜的培養(yǎng)條件是：pH為6.0，在裝液量為60 ml/250 ml三角瓶中接種10%種齡為72 h的液體種子，于30 ℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，轉速為180 r/min，發(fā)酵6 d，發(fā)酵液色價可達19.2 U/ ml。

將得到的發(fā)酵液濃縮，用減壓蒸餾的方法，得到的濃縮液再放入90 ℃的鼓風烘干機中烘干即可得到紅色的塊狀固體［22］。經(jīng)過4層紗布過濾后的濾渣可以在100 ℃烘干后研磨成粉末，其胞內(nèi)色素可用70%的乙醇于60 ℃水浴鍋中浸提，提取時間為60 min。

紅曲霉的研究早已涉入次生代謝產(chǎn)物等生物活性物質，我國紅曲生產(chǎn)的優(yōu)勢目前在固態(tài)發(fā)酵方面，主要用于制作酒曲、白酒酯化和紅曲米，作色曲的紅曲米及功能紅曲米，因我國的紅曲米生產(chǎn)成本低，故具有一定的競爭力。我國的另一優(yōu)勢在于擁有豐富的紅曲霉菌種資源，有利于結合遺傳學進行基因工程改造，更深入地開發(fā)紅曲霉的潛能?？傊贸Ｒ?guī)方法、原生質體融合及基因重組等技術在紅曲霉菌株的選育，紅曲霉菌發(fā)酵先進的生產(chǎn)工藝改進與科學管理，利用酶同定化技術、微膠囊技術對紅曲系列產(chǎn)品的研究開發(fā)等諸多方面均有較好的發(fā)展前景。

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