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      橡子淀粉乙醇化酵母菌種的篩選

      2014-04-29 21:39:40欒泰龍等
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年36期
      關(guān)鍵詞:橡子發(fā)酵篩選

      欒泰龍等

      摘要

      [目的] 篩選適于以橡子淀粉為發(fā)酵原料的高性能優(yōu)良酵母菌種。 [方法]從幾種工業(yè)上較常用的酒精用酵母中,篩選適合于橡子淀粉質(zhì)原料發(fā)酵的菌種,對(duì)它們的發(fā)酵性能、酒精產(chǎn)量、殘?zhí)呛康确矫孢M(jìn)行分析比較。[結(jié)果]分析得出,南陽(yáng)6號(hào)酵母較其他菌株的酒精產(chǎn)率高、殘還原糖低,發(fā)酵性能優(yōu)良;而蘭州L166發(fā)酵性能較高,同時(shí)耐受性好,南陽(yáng)6號(hào)與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的菌株。[結(jié)論]在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,應(yīng)根據(jù)橡子原料中成分的不同對(duì)相應(yīng)菌種加以選用。

      關(guān)鍵詞橡子;發(fā)酵;釀酒酵母;篩選

      中圖分類號(hào)S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2014)36-13028-03

      Abstract[Objective] To screen out high performance excellent yeast strains with acorn starch as fermentation raw material. [Method] The appropriate strains were selected from several commonly used yeasts in industry, the fermentation performance, alcohol yield and the content of residual sugar were compared. [Result] Compared with other strains, yeast of Nanyang No.6 has higher alcohol yield, lower residual reducing sugar, and excellent fermentation performance; Lanzhou L166 has higher fermentation performance and good tolerance, Nanyang No.6 and Lanzhou L166 are appropriate strains for producing ethanol by acorn starch fermentation. [Conclusion] In practical production process, appropriate strains should be selected according to composition of acorn raw material.

      Key words Acorn; Fermentation; Yeast for ethanol production; Screening

      燃料乙醇屬于可再生能源,是一種綠色、清潔的能源。燃料乙醇的抗爆性能良好,將其用作車用燃料能夠使燃燒更加充分, 大大降低汽車尾氣排放量, 降低對(duì)環(huán)境的污染。燃料乙醇作為替代石油能源的綠色可再生能源日益受到人們的關(guān)注。大量使用燃料乙醇除了對(duì)環(huán)境的保護(hù)益處明顯外,還降低了國(guó)家對(duì)進(jìn)口石油的依賴程度、降低能源支出在社會(huì)消費(fèi)中所占的比例等,使用燃料乙醇意義重大[1-2]。

      我國(guó)櫟類資源豐富、分布區(qū)域廣泛,橡子種仁中淀粉含量高,是代替糧食作物制備生產(chǎn)燃料乙醇的理想來(lái)源[3]。燃料乙醇的生產(chǎn)目前主要采用發(fā)酵法,發(fā)酵時(shí)淀粉水解為可發(fā)酵性糖,進(jìn)而被微生物轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳,在這個(gè)過(guò)程中菌株發(fā)酵性能的高低就成為了影響淀粉利用率和酒精產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。以橡子淀粉為發(fā)酵原料的菌種應(yīng)具有酒精產(chǎn)量高、淀粉利用率好、適應(yīng)性強(qiáng)、抗性好等特點(diǎn)[4]。篩選以橡子淀粉為發(fā)酵原料的優(yōu)良酵母菌種,不僅可以提高酒精發(fā)酵質(zhì)量和淀粉出酒率,而且能降低原料消耗及生產(chǎn)成本。筆者選取幾種工業(yè)上較常用的酒精用酵母,從發(fā)酵菌株的發(fā)酵性能、酒精產(chǎn)量、殘?zhí)呛考澳托缘确矫孢M(jìn)行試驗(yàn),以期得到適于橡子發(fā)酵的高性能酵母菌種。

      1材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1

      供試菌種。黃海109、蘭州L166、天津R12、濟(jì)南Rasse12、南陽(yáng)5號(hào)、6號(hào),分別編號(hào)為XZ01~XZ06,以上酵母菌種由黑龍江省微生物研究所提供。

      1.1.2

      主要試劑。葡萄糖、酵母膏、氯化銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉,苯酚、亞硫酸鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇等,均為分析純。

      1.1.3

      主要儀器。XFS280A手提式壓力蒸汽滅菌器,浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;HWS28電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;722N可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;HPX9272 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;RE 5286A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠。

      1.1.4

      培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)基:蛋白胨 2%,酵母膏1%,葡萄糖2%,pH 6.0(固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%~2.0%),115 ℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15.0 g,酵母浸膏0.5 g,NH4Cl 0.1 g,MgSO4·7H2O 0.06 g,蛋白胨0.5 g,KH2PO4 0.1 g, 用蒸餾水定容至100 ml,培養(yǎng)基pH用H2SO4調(diào)節(jié)至4.5,121 ℃溫度下滅菌20 min。

      1.2試驗(yàn)方法

      試驗(yàn)選取南陽(yáng)6號(hào)等6種酒精用酵母為發(fā)酵菌株,通過(guò)對(duì)發(fā)酵菌株的產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)氣量、殘?zhí)呛康确矫娴倪M(jìn)行比較,以得到適合于橡子淀粉發(fā)酵的高性能酵母菌種。

      1.2.1

      酵母產(chǎn)氣性能試驗(yàn)。將待試的不同酵母菌株活化好后接種至250 ml三角瓶中,接種量2%,將三角瓶置于28 ℃條件下恒溫發(fā)酵至結(jié)束。CO2失重的測(cè)定:采用直接稱重法,每經(jīng)過(guò)24 h將三角瓶稱重1次直至發(fā)酵自然停止,計(jì)算接種發(fā)酵后在單位時(shí)間內(nèi)CO2的釋放量。

      1.2.2

      產(chǎn)酒精能力的測(cè)定[5]。酒精含量的測(cè)定:采用比重計(jì)法。發(fā)酵結(jié)束后取100 ml發(fā)酵醪液置于500 ml蒸餾瓶?jī)?nèi),并加100 ml蒸餾水,加熱蒸餾直至餾出 100 ml溶液,用酒精比重計(jì)測(cè)定餾出液中的酒精度,同時(shí)測(cè)定餾出液的溫度,并換算為20 ℃時(shí)的酒精濃度。

      1.2.3

      殘?zhí)呛康臏y(cè)定[6]。發(fā)酵結(jié)束后取5 ml醪液過(guò)濾,將濾液稀釋至100 ml容量瓶,用DNS法測(cè)定。

      1.2.4

      酵母耐性試驗(yàn)。將酵母分別接入含不同乙醇濃度(0%vol、3%vol、6%vol、9%vol、12%vol)、葡萄糖濃度(100、200、300、400、500 g/L)、單寧濃度(1%、2%、3%、4%、5%)的發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃條件下恒溫發(fā)酵,分別測(cè)量發(fā)酵后的OD560值。

      2結(jié)果與分析

      2.1 酵母發(fā)酵性能結(jié)果

      在發(fā)酵過(guò)程中,釀酒酵母經(jīng)過(guò)不斷利用底物原料產(chǎn)生酒精,并釋放出CO2,發(fā)酵液重量隨之減少。但是各酵母菌株的代謝能力有一定差異,對(duì)底物原料的利用程度不同,導(dǎo)致最終產(chǎn)氣量存在差別。

      通過(guò)測(cè)定發(fā)酵后幾株酵母的產(chǎn)氣量,并將其記錄下來(lái),以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo),發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制CO2產(chǎn)生量曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,在接種24 h內(nèi)幾種菌株都能快速地開(kāi)始發(fā)酵,并且以菌株XZ02產(chǎn)氣量較多,隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行,各菌株的產(chǎn)氣量均有增加,尤其以24~72 h內(nèi)產(chǎn)氣量增幅最大,而在發(fā)酵72 h后CO2產(chǎn)生量逐漸下降。發(fā)酵終止時(shí),累計(jì)發(fā)酵產(chǎn)氣量以菌株XZ02略高,而其他幾個(gè)酵母菌株與其相比,產(chǎn)氣量依次降低。

      2.2酒精產(chǎn)量及殘?zhí)呛康臏y(cè)定結(jié)果

      各菌株接入培養(yǎng)基后經(jīng)過(guò)發(fā)酵,試驗(yàn)結(jié)果顯示,XZ06在發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)酒精量最多,為14.2%vol,XZ04其次。對(duì)發(fā)酵液中的酒精含量進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)各菌株發(fā)酵后XZ06、XZ04的酒精含量顯著高于其他4種酵母菌(P<0.05),產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)。

      殘還原糖含量低,表明發(fā)酵液中原料利用充分。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以看出,發(fā)酵后菌株XZ03的殘?zhí)呛孔畹?,?.12 g/L,XZ06其次。對(duì)發(fā)酵后的殘?zhí)呛窟M(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后XZ03、XZ06的殘?zhí)呛匡@著低于其他4種酵母菌(P<0.05),表明這2個(gè)菌株利用糖類的能力較強(qiáng),能使發(fā)酵進(jìn)行的比較徹底。

      2.3酵母耐性試驗(yàn)結(jié)果

      2.3.1

      乙醇耐性試驗(yàn)。

      將活化好的酵母菌分別接入不同酒精濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵,截取發(fā)酵48 h時(shí)的酵母生長(zhǎng)情況,比較它們?cè)诓煌凭珴舛葪l件下的生長(zhǎng)情況,其結(jié)果見(jiàn)圖3。

      從圖3中可以看出,在初始發(fā)酵液中酒精濃度為0%vol~6%vol的條件下,發(fā)酵48 h后幾種酵母的吸光度值逐漸下降,其中以XZ05、XZ06下降速率較快,XZ01、XZ02 2個(gè)菌株下降較平穩(wěn)。當(dāng)在初始發(fā)酵液中酒精濃度達(dá)到6%vol~12%vol的條件時(shí),經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵,6種菌株的吸光度值下降均較快,說(shuō)明在較高酒精濃度條件下,各菌種的酒精耐受能力下降較大,但最終以XZ01、XZ02的吸光度值略高。從各種酵母菌株的酒精耐受比較結(jié)果可以看出,XZ01、XZ02比其他酵母菌株具有更強(qiáng)的耐受酒精能力。

      2.3.2

      糖濃度耐性試驗(yàn)。

      將活化好的酵母菌分別接入不同葡萄糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)24 h發(fā)酵后的吸光度值,比較各菌株在不同葡萄糖濃度條件下菌體的生長(zhǎng)情況。通過(guò)圖4顯示出,當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度在100~200 g/L時(shí),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng),各酵母菌株發(fā)酵液的吸光度均較大。隨后隨著糖濃度的增大,各菌株的吸光度均減小,說(shuō)明發(fā)酵液中的糖濃度含量在100~200 g/L時(shí)更適合這幾種酵母菌株的生長(zhǎng)。當(dāng)糖濃度升高到500 g/L時(shí),各酵母生長(zhǎng)都趨于緩慢,同時(shí)XZ01~XZ04吸光度接近,但高于XZ05、XZ06。

      發(fā)酵結(jié)果表明,當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度較低時(shí),幾種菌株發(fā)酵狀況良好,當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度較高時(shí),XZ05、XZ06的糖耐受性低于其他菌株。初始的發(fā)酵糖濃度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)存在一定的影響,因此,在以橡子淀粉為發(fā)酵原料的培養(yǎng)基中應(yīng)根據(jù)淀粉水解程度選擇適合于發(fā)酵的酵母菌。

      2.3.3

      單寧濃度試驗(yàn)。

      各酵母菌種在含不同濃度單寧的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24 h發(fā)酵,其結(jié)果如圖5。從圖5中可以看出,發(fā)酵過(guò)程隨單寧濃度的升高整體呈下降趨勢(shì)。XZ01、XZ03 2個(gè)菌株在各個(gè)濃度下均生長(zhǎng)緩慢,XZ04在1%~2%單寧濃度范圍內(nèi)吸光度值下降較快,表示這3個(gè)菌株在低單寧濃度時(shí)即受到較大抑制,其他3個(gè)菌株在各濃度條件下吸光度值下降均勻,其中XZ02的吸光度值相對(duì)較高,在5%單寧濃度條件下XZ06吸光度最大,

      3 結(jié)論

      橡子中淀粉含量高,是潛在的重要淀粉質(zhì)原料來(lái)源,以橡實(shí)淀粉為原料制備燃料乙醇具有良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果,分別從酒精產(chǎn)率和菌株耐性等方面綜合考慮,南陽(yáng)6號(hào)較其他菌株的酒精產(chǎn)率高、殘還原糖低,發(fā)酵性能優(yōu)良;而蘭州L166發(fā)酵性能較高,同時(shí)耐受性好,南陽(yáng)6號(hào)與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的菌株。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,應(yīng)根據(jù)橡子原料中成分的不同對(duì)相應(yīng)菌種加以選用。

      參考文獻(xiàn)

      [1]

      馬歡,劉偉偉,張無(wú)敵,等.燃料乙醇的研究進(jìn)展及存在問(wèn)題[J].能源工程,2006(2):29-33.

      [2] 蘇小軍,熊興耀,譚興和,等.燃料乙醇發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,33(4):480-484.

      [3] 田玉峰,李安平,謝碧霞,等.橡實(shí)淀粉生物乙醇化橡實(shí)品種和菌種的篩選[J].食品科學(xué),2011,32(7):207-210.

      [4] 李箏,韓北忠,陳晶瑜,等.優(yōu)良釀酒酵母菌的發(fā)酵性能研究[J].中國(guó)釀造,2008(19):10-12.

      [5] 李安平,謝碧霞,沈偉,等.橡實(shí)淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精專用酵母菌株的篩選[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(8):98-102.

      [6] 梁瑋,施翔星.木薯干發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇潛力研究[J].中外能源,2010,15(5):31-34.

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