IL-18在病理性瘢痕中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

吳澤勇 張培華 李瑾 李小芳 楊春燕

[摘要]目的：比較IL-18在正常皮膚和病理性瘢痕組織中的表達(dá)及分布情況，探討IL-18在病理性瘢痕的形成過程中所起的生物學(xué)作用及意義。方法：收集2006年12月到2007年6月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的正常皮膚10例，增生性瘢痕組織12例，瘢痕疙瘩12例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及熒光定量RT-PCR分別檢測(cè)IL-18蛋白及IL-18 mRNA在它們中的表達(dá)水平及分布情況。結(jié)果：IL-18在正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中均有表達(dá)，IL-18mRNA和 IL-18蛋白在瘢痕疙瘩組和增生性瘢痕組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)，但兩者均低于正常皮膚組(P<0.05)。結(jié)論：IL-18可能是病理性瘢痕組織的形成促進(jìn)因素之一。

[關(guān)鍵詞]IL-18；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩；RT-PCR；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2014）06-0454-03

The expression of IL-18 in pathological scars and its biological effect

WU Ze-yong,ZHANG Pei-hua,LI-Jin,LI Xiao-fang,YANG Chun-yan

（1.Department ofPlastic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001,Guangdong,China; 2.Department ofPathology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College; 3.Surgery Laboratory of Clinical Skills Training Center,Guangdong Medical College）

Abstract:ObjectiveComparing the expression and distribution of IL-18 in the normal skin and pathological scars, To explore the biological contribution of lL-18 in the formative course of hypertrophic scard.MethodsFrom December 2006 to June 2007，10 cases of normal skin, 12 cases of proliferative scar and 12 cases of keloid tissues were collected at Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College.Take normaI skin as control group,Applicating immunohistochemical technique and fluorescence quantitative RT-PCR, to detect the expression level and distribution of IL - 18 protein and IL - 18 mRNA in them. ResultsThe expression of IL-18 protein and IL-18 mRNA was both obviously lower in hypertrophic scar and keloid tissues compared with those of narmal skin respectively y(P<0 05).ConcIusionThe results indicated that IL-18 maybe one of the factors to promote pathological scar tissue forming.

Key words:IL-18;hypertrophic scars;keloid;RT-PCR;immunohistochemical

病理性瘢痕為皮膚創(chuàng)傷后形成的過度增生性疾病，破壞人體表面完整性和組織器官正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致創(chuàng)傷部位畸形，功能障礙，影響美觀，給患者帶來(lái)極大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，一般認(rèn)為是由創(chuàng)傷的遷延愈合，修復(fù)細(xì)胞中成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡所引起，主要包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，其中瘢痕疙瘩又稱瘢痕瘤，具有某些良性腫瘤的特征，與腫瘤發(fā)生在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上存在許多共同點(diǎn)。白細(xì)胞介素18(Interleukin-18，IL-18)能刺激 T 細(xì)胞及 NK 細(xì)胞分泌 IFN-γ，增強(qiáng)穿孔素及 FasL 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用, 在增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗微生物感染等方面具有重要作用, 并在腫瘤的生物治療中表現(xiàn)出廣泛應(yīng)用前景。IL-18是否在病理性瘢痕的形成中發(fā)揮作用，目前國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察 IL-18 在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平和分布情況，探討IL-18與病理性瘢痕的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 材料：收集2006年12月至2007年6月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的標(biāo)本共34例，其中，瘢痕疙瘩組織12例，男性4例，女性8例，年齡15～36歲，平均23歲；增生性瘢痕組織12例，男性5例，女性7例，年齡10～37歲，平均18.5歲；正常皮膚10例，男性5例，女性5例，年齡18～45歲，平均26歲。正常皮膚取自除皺、包皮環(huán)切術(shù)及外傷多余皮膚，病理性瘢痕取材部位為顏面、前胸、腹部、四肢等，病程為3～24月，患者無(wú)慢性病史及長(zhǎng)期服用藥物史，瘢痕未進(jìn)行局部藥物注射治療，患者知情同意。標(biāo)本切取后去除皮下組織，用生理鹽水清洗，用組織剪將組織塊修成0.5cm×0.5cm大小，部分迅速置于液氮保存；部分置入4%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋備用。

1.2real time RT-PCR檢測(cè)IL-18 mRNA的表達(dá)：引物由上海意泓生物科技有限公司合成， Interleukin 18上游引物：5' -CAAGGAAATCGGCCT CTATTT-3'；下游引物：5' - CCTCTAGGCTGGCTATCTT TATACATACT-3'。內(nèi)參照GAPDH上游引物：5'-GGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3'，下游引物：5'-TTG CCGACAGGATGCAGAAGGA-3'。第一步按照Trizol試劑盒（TOYOBO公司）操作說明書提取標(biāo)本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；第二步做熒光定量PCR，95℃ 5min；接著95℃ 15s，60℃ 15s， 72℃ 32s；40個(gè)循環(huán)（72℃ 32s收集熒光信號(hào)）；同時(shí)，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果采用比較法測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)（即目的基因量= 2△△Ct），分析病理性瘢痕組織與正常皮膚IL-18 mRNA的表達(dá)差異。

1.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)IL-18蛋白的表達(dá)：標(biāo)本切取后，常規(guī)制備石蠟切片，干燥保存。按IL-18試劑盒（Santa Cruz, Europe）說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)（SP法）檢測(cè)。每批標(biāo)本均用 PBS 代替一抗作為空白對(duì)照。IL-18 陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，均呈棕黃色顆?；驁F(tuán)快樣分布。每張染色切片由兩人分別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。采用IPP7.0圖像分析軟件，每張染色切片自表皮層向真皮層按系統(tǒng)抽樣法隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的累積光密度和所有細(xì)胞總面積，以每例5個(gè)視野的平均光密度作為該例的測(cè)量值，平均光密度=陽(yáng)性反應(yīng)的累積光密度/細(xì)胞總面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，三組間差異采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 IL-18 mRNA在正常皮膚及病理性瘢痕中的表達(dá)：IL-18 mRNA擴(kuò)增曲線呈典型的S型，熔解曲線為單峰，排除非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的出現(xiàn)。10例正常皮膚、12例增生性瘢痕和12例瘢痕疙瘩的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR相對(duì)轉(zhuǎn)錄量檢測(cè)結(jié)果分別為1.6513±0.2632、1.2931±0.1805、1.3058±0.2107。正常皮膚表達(dá)量均高于增生性瘢痕和12例瘢痕疙瘩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩表達(dá)量相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 IL-18蛋白的在正常皮膚及病理性瘢痕中的表達(dá)：IL-18蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞間質(zhì)中，呈棕黃色，在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中均有表達(dá)，主要集中于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩表皮的顆粒細(xì)胞層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層的細(xì)胞與正常皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞及其結(jié)締組織、毛細(xì)血管、淋巴管中，從總體上看，增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組中IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)量均較弱，見圖1～4，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者均低與正常皮膚組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

1995年日本學(xué)者Okamure等[1]首次從滅活痤瘡丙酸桿菌和脂多糖共處理過的中毒性休克小鼠肝臟的一種由應(yīng)激誘生的蛋白，由于這種細(xì)胞因子能誘導(dǎo)Thl等細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，因而起初被命名為IFN-γ誘生因子，1996年Ushio等[2]克隆出人類IGIF的cDNA并在E.Coli中表達(dá)，鑒于IGIF的氨基酸序列與IL-1α、IL-1β有同源性，但缺乏IGIF與IL-1受體結(jié)合的證據(jù)，繼而研究發(fā)現(xiàn)該因子還具有多種生物學(xué)活性，因此被重新命名為白介素18（IL-18）。IL-18為多功能細(xì)胞因子，能刺激T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞分泌IFN-γ ，增強(qiáng)穿孔素及FasL 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，在自身免疫性疾病、心衰、肺氣腫、急性腎炎、抗微生物感染等方面具有重要的作用[3]。在腫瘤研究方面，已有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，IL-18能通過腺病毒介導(dǎo)的，過度產(chǎn)生IL-18，能有效的抑制腎癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[4-5]。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)提示，IL-18通過FasL-Fas系統(tǒng)，提高細(xì)胞毒性CD+T淋巴細(xì)胞的活性，抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

瘢痕疙瘩是人類特有的一種良性的皮膚纖維增殖腫瘤，具有腫瘤生長(zhǎng)的某些特點(diǎn)[6]。很多抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞因子，都被引入到病理性瘢痕的研究中，并取得良好的效果。IL-18通過T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)IFN-γ的分泌及FasL-Fas系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。IL-18是否通過類似的途徑，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡而抑制瘢痕增生，在瘢痕的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮怎樣的重要作用呢？

目前研究已證明，IFN-γ通過TGF-β/Smad上調(diào)Smad 7、下調(diào)Smad 3，減少CTGF和α-SMA，抑制瘢痕增生[8]。而增生性瘢痕及瘢痕疙瘩均有Fas表達(dá)，后者表達(dá)量更高，但其敏感性均較低，提高Fas的敏感性將是瘢痕治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[9]。IL-18能分泌IFN-γ且可通過FasL-Fas系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此我們將IL-18基因引入到病理性瘢痕當(dāng)中進(jìn)行研究，通過定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明IL-18基因在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表達(dá)與正常皮膚相比較，明顯減弱(P<0.05)，說明，IL-18基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)存在異常。

免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，IL-18蛋白在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表達(dá)與正常皮膚相比較，明顯減弱(P均<0.05)，說明IL-18蛋白在翻譯水平也存在異常。由定量RT-PCR結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果，我們可以初步推斷，與正常皮膚組織相比，病理性瘢痕組織中，IL-18mRNA表達(dá)異常，導(dǎo)致IL-18蛋白合成的減少，繼而細(xì)胞IFN-γ分泌減少及FasL-Fas系統(tǒng)活性降低，使瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡失衡，最終導(dǎo)致瘢痕組織的增生。

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[收稿日期]2014-01-26[修回日期]2014-03-04

編輯/張惠娟