高效液相色譜法測定腎炎溫陽片中大黃酚含量

李秀賢 ，柏丹鳳，田金苗，王怡君

（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110034； 2．上海新先鋒藥業(yè)有限公司，上海 201203；3．遼寧省食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110023）

腎炎溫陽片由黃芪、大黃、人參、附子(鹽制)、黨參、茯苓、肉桂、香加皮、木香、白術(shù)、葶藶子等組方，具有溫腎健脾、化氣行水的功效，用于慢性腎炎，癥見脾腎陽虛、全身浮腫、面色蒼白、脘腹脹滿、納少便溏、神倦尿少。原標(biāo)準(zhǔn)收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(1998年)，有顯微鑒別人參、理化鑒別大黃、薄層鑒別大黃和香加皮，沒有含量測定項。為更好地控制本品質(zhì)量，在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了大黃酚含量測定項，經(jīng)對樣品進(jìn)行檢驗，該標(biāo)準(zhǔn)能有效地控制腎炎溫陽片的質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC－2010C型高效液相色譜儀（日本島津公司）。大黃酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110796－200514）；腎炎溫陽片（遼寧好護(hù)士藥業(yè)＜集團(tuán)＞有限責(zé)任公司，批號為 111201，111202，111203；甲醇、乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司），重蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗[1－4]

色譜柱：Waters C18柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm)；流動相：甲醇 －0．1% 磷酸溶液（85 ∶15）；流速：1 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按大黃酚峰計算應(yīng)不低于4 000。

2．2 溶液制備

取大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得對照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，濾過，用少量甲醇洗滌錐形瓶及濾器，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣加8%鹽酸溶液10 mL，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例制備缺大黃的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗：精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，繪制色譜圖。可見，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照品溶液在此峰處無干擾。在此色譜條件下，大黃酚可與其他成分基線分離。結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取大黃酚對照品9．20 mg，用甲醇轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻；精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 mL含大黃酚0．009 2 mg的對照品溶液。分別精密吸取大黃酚對照品溶液 1，5，10，25，50 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1 296 895．025 1 X －914．661 3，r＝0．999 9。結(jié)果表明，大黃酚進(jìn)樣量在 0．009 2～0．460 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果大黃酚峰面積的 RSD為0．2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于配制后 0，10，16，22，30 h 時進(jìn)樣分析，測定峰面積。結(jié)果大黃酚峰面積的 RSD為0．6%，表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取本品(批號為111201)約1．0 g，精密稱定，共取6份，按供試品溶液制備方法測定，注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，計算含量。結(jié)果平均含量為 0．879 8 mg／g，RSD為1．0%，表明本試驗重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知準(zhǔn)確含量的同一批樣品(批號為 111201)6份，各 0．5 g，分別精密加入大黃酚對照品溶液(0．092 g ／L)4，5，6 mL，按照供試品溶液制備方法操作，測定加標(biāo)樣品中大黃酚的含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測定

按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果 3批腎炎溫陽片中大黃酚的含量分別為 0．879 8，0．881 1，0．877 2 mg ／g。

3 討論

取大黃酚對照品的甲醇溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果大黃酚的最大吸收波長為254 nm，同時參考2010年版《中國藥典（一部）》大黃含量測定項，故選定254 nm為大黃酚的測定波長[5－7]。在本方中黃芪具有補氣升陽、利水消腫的功效，在處方中量最大，為君藥，考慮增加黃芪甲苷的含量測定，但經(jīng)試驗，黃芪甲苷含量測定的回收率過低，不能達(dá)到中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求，故未增加黃芪甲苷的含量測定。在本方中大黃具有清熱瀉火的功效，在處方中量較大，為臣藥，原標(biāo)準(zhǔn)中有大黃的理化鑒別，專屬性不強，還有大黃的薄層鑒別，方法較成熟，作為定性鑒別專屬性強，為了更好地控制本品的質(zhì)量，本次試驗考察了大黃中大黃酚的含量測定，方法簡單、可靠，可作為腎炎溫陽片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

表1 大黃酚加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

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