高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定抗腦衰膠囊中3種成分含量

賈永亮，韓桂茹，李曉燕

（1．河北省鹽山人民醫(yī)院藥劑科，河北 滄州 061300； 2．河北省食品藥品檢驗(yàn)院，河北 石家莊 050011；3．河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035）

目前，中藥復(fù)方提取制劑的質(zhì)量控制方法多是單成分的定量測(cè)定[1－3]，一個(gè)含 3 項(xiàng)含量測(cè)定的質(zhì)量檢測(cè)[4－5]，至少需 3 d，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)資，制約著多組分定量測(cè)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。為尋求高效率、低成本、一測(cè)多評(píng)的快速測(cè)定方法，筆者對(duì)抗腦衰膠囊（由熟地黃、制何首烏、人參、黃芪、白芍、遠(yuǎn)志、茯神、石菖蒲、酸棗仁、卵磷脂、枸杞子、葛根、丹參、黃芩、維生素 E等21味藥物組方）進(jìn)行了多組分同時(shí)定量測(cè)定研究。雖有文獻(xiàn)報(bào)道抗腦衰膠囊中葛根素和二苯乙烯苷的測(cè)定[6]方法，但要求用Nova－Pak C18色譜柱，在320 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)2種成分含量，葛根素因處于吸收峰的尾端，靈敏度低。筆者首次采用等度洗脫、普通C18反相色譜柱同時(shí)測(cè)定葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津 LC－10ADVP泵、SPD－M10AVP二極管陣列檢測(cè)器、CLASS－VP LC色譜工作站）?？鼓X衰膠囊（石家莊四藥有限公司，批號(hào)為 050104，041069，041071），葛根素對(duì)照品（批號(hào)為110752－200511，供含量測(cè)定用），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736－200526，供含量測(cè)定用），二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)為110844－200404，供含量測(cè)定用），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。流動(dòng)相所用試劑為色譜純，其他試劑、試藥均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈－0．1%磷酸（12 ∶88）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：室溫；流速：1．0 mL ／min。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2．2 溶液制備

分別精密稱取葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷對(duì)照品適量，加30%甲醇制成每 1 mL含葛根素 0．01 mg、芍藥苷 0．015 mg、二苯乙烯苷0．013 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0．11 g，精密稱定，置容量瓶中，加 60%的甲醇20 mL，超聲處理10 min，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。取缺少葛根或白芍或何首烏的樣品，按供試品溶液方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

采用日本島津公司生產(chǎn)的二極管陣列高效液相色譜儀，對(duì)樣品和對(duì)照品的高效液相色譜峰分別進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，葛根素在紫外區(qū)有3個(gè)吸收峰，且對(duì)照品和供試品波峰一致，分別在200，250和305 nm波長(zhǎng)處；芍藥苷有2個(gè)吸收峰，且對(duì)照品和供試品波峰一致，分別在200和230 nm波長(zhǎng)處；二苯乙烯苷有2個(gè)吸收峰，且對(duì)照品和供試品波峰一致，分別在213和320 nm波長(zhǎng)處。從3種成分的光譜圖可見，其共有的最佳吸收在230 nm波長(zhǎng)處，該處正是芍藥苷的最大吸收波長(zhǎng)；對(duì)于葛根素和二苯乙烯苷，該處正是二者的吸收交叉點(diǎn)，雖不是其最大吸收波長(zhǎng)，但也均處于較高的吸收處，故擬以230 nm為三者的共有測(cè)定波長(zhǎng)，見圖1。

2．4 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，陰性無干擾，見圖2。

圖1 3種成分光譜掃描圖

線性關(guān)系考察：分別精密稱取葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷對(duì)照品適量，加 30%的甲醇制成每 1 mL含葛根素 2．17，5．43，1．357，33．92，50．88 μg， 含 芍 藥 苷 3．74，9．34，23．36，58．40，146 μg，含二苯乙烯苷 2．82，7．04，17．6，44，110 μg 的溶液。各進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y葛＝3 673 540 X＋9 137（r＝ 0．999 8），Y芍＝1 494 009．4 X ＋ 2 859（r＝0．999 9），Y二＝2 473 263．6 X ＋46 441(r＝0．999 7)。結(jié)果表明，進(jìn)樣量葛根素在 0．043 4 ～ 1．018 μg、芍藥苷在 0．074 8 ～ 2．92 μg、二苯乙烯苷在0．056 4～2．2 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積平均值葛根素為 932 898(RSD為 0．88%)，芍藥苷 為 645 014(RSD為 0．67%)，二苯乙烯苷為 874 332(RSD為 1．22%)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，每隔3 h進(jìn)樣1次，考察18 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果峰面積平均值葛根素為831 047(RSD為1．02%)，芍藥苷為 553 830(RSD 為 1．57%)，二苯乙烯苷為550 308(RSD為 1．16%)，表明供試品溶液中葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按高、中、低3個(gè)劑量，取同一批（批號(hào)為041069）樣品6份，按2．2項(xiàng)下方法及擬訂色譜條件進(jìn)行提取，制備，測(cè)定。結(jié)果平均含量葛根素為 2．08 mg／g(RSD 為 1．16%)；芍藥苷 為 1．95 mg ／g(RSD 為 1．36%)， 二 苯 乙 烯 苷 為 3．17 mg ／g(RSD為2．32%)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為041069）樣品6份，每份0．055 g，按高、中、低 3個(gè)劑量分別加入一定量的對(duì)照品，按擬訂方法處理進(jìn)行提取、制備、測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表 1。

表1 葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

色譜柱耐用性試驗(yàn)：取同一（批號(hào)為041069）供試品溶液，選用不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果3種色譜柱的測(cè)定結(jié)果基本一致，表明3種成分分離良好，見表2。

表2 不同色譜柱測(cè)定的同一樣品含量(mg／g)

2．5 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

3 討論

已有其他樣品中葛根素與芍藥苷含量測(cè)定的研究，但因組方不同，測(cè)定方法各異，有單獨(dú)測(cè)定[7－8]，也有采用同一流動(dòng)相在240 nm或230 nm波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定[9－10]，前者比后者多花費(fèi)1倍的時(shí)間與試劑。其他樣品中葛根素與二苯乙烯苷含量測(cè)定的研究多采用梯度洗脫，在各自最大波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定[11－12]，要求儀器必須配備梯度洗脫與二極管陣列檢測(cè)器，儀器的性能、成本提高，應(yīng)用受限，難以普及。雖然有同時(shí)測(cè)定芍藥苷與二苯乙烯苷的報(bào)道[13]，但是與其他成分一同測(cè)定的，在230 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下要經(jīng)7次梯度變換，波峰基線平穩(wěn)度不好。目前尚未見同時(shí)測(cè)定葛根素、芍藥苷與二苯乙烯苷3種成分的報(bào)道。

本研究采用島津高效液相SPD－M10AVP二極管陣列檢測(cè)器，同時(shí)考察了葛根素和二苯乙烯苷在各自最大波長(zhǎng)250，320 nm和共有測(cè)定波長(zhǎng)230 nm下的線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示，二者在各自最大波長(zhǎng)和共有測(cè)定波長(zhǎng)下基本一致，而且同一供試品在各自最大波長(zhǎng)和共有測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定的含量無差異。因此，采用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，只需一臺(tái)帶紫外檢測(cè)器的普通色譜儀，即可準(zhǔn)確進(jìn)行3種中藥所含3類性質(zhì)各異的成分的定量測(cè)定，成本低，效率高，值得推廣。

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