HPLC-MS/MS法同時測定生藥梔子主要成分

嘎拉沁·滿都拉, 上井幸司，湯口實，巖佐達(dá)郎*

(1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學(xué)，日本 北海道室蘭050-8585)

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HPLC-MS/MS法同時測定生藥梔子主要成分

嘎拉沁·滿都拉1,2, 上井幸司2，湯口實2，巖佐達(dá)郎2*

(1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學(xué)，日本 北海道室蘭050-8585)

目的：建立梔子中主要活性成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷同時進(jìn)行定性定量分析方法。方法：采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，同時測定梔子水提取液中主要成分。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，正離子檢測，掃描范圍10～1000(m/z)；色譜測定使用ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱，以甲醇-水梯度洗脫，流速0.2mL· min-1，檢測波長240nm，柱溫30℃。結(jié)果：梔子中確定了京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷等3種成分；在定量分析中主要成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100μg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=1.000 00和r =0.999 98)。結(jié)論：HPLC-MS/MS法對梔子中主要成分可準(zhǔn)確、快速、同時進(jìn)行定性定量分析，對生藥梔子的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

梔子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龍膽二糖苷

梔子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科(Rubiaceae)植物梔子，其干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效[1]。其化學(xué)成分主要含環(huán)烯醚萜類成分，如京尼平苷(geniposide)、京尼平龍膽二糖苷(genipingentiobioside)、羥異梔子苷(gardenoside)、京尼平苷酸(geniposidic acid)等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛、輻射防護(hù)、降血脂等多種藥理活性，已成為目前研究的熱點[3]。

HPLC/MS/MS技術(shù)在中藥化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及指紋圖譜研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢[4,5]。目前，已有的研究是對梔子中梔子酸、京尼平苷(梔子苷)、西紅花苷、京尼平等進(jìn)行HPLC含量測定[6-9]，或者對梔子的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析[10-12]，而用色譜法與質(zhì)譜法同時測定梔子中京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷進(jìn)行定性和定量分析的研究未見相關(guān)報道。筆者采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定梔子中化學(xué)活性成分，并對其色譜峰保留時間、一級和二級掃描質(zhì)譜圖與對照品比較，對京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷進(jìn)行了定性定量分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀Prominence LC-20A (日本SHIMADZU公司)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000 LC/MS/MS三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)，數(shù)控式超聲波細(xì)胞粉碎器，SONOPULS UW2070, BANDELIN，高速大容量冷卻離心機(jī)7780(日本KUBOTA)，Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司)，紫外可見光分光光度計UVmini-1240(日本島津)。

1.2 試劑

流動相用甲醇為色譜純，日本(Wako)；蒸餾水為HPLC用蒸餾水；對照品京尼平苷，日本(Wako)，批號00007070-212；對照品京尼平龍膽二糖苷，四川省維克奇生物科技，批號130527；梔子(購于內(nèi)蒙古藥店)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷分別配置1mg·mL-1的水溶液和1∶1的混合對照品儲備溶液，使用前再稀釋100倍。

2.2 供試品溶液制備

生藥梔子研細(xì)，過60目篩，精密稱取粉末0.5g，加超純水10mL，超聲 (70W、20kHz) 提取30min，高速離心機(jī)離心(3 000rpm)20min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得。HPLC測定時將供試品溶液再稀釋1 000倍后使用。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱；流動相：甲醇-水溶液(梯度洗脫)；流速：0.2mL/min；檢測波長：240nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：0.5μL。

質(zhì)譜條件:電離源：電噴霧離子源 (ESI)；掃描模式：正離子檢測(positive)；掃描范圍：10～1100(m/z)；毛細(xì)管電壓(IS)：LC-MS為5 500 V; MS/MS為4 500 V; 霧化器壓強(qiáng)：LC-MS為50 psi; MS/MS為17 psi；干燥器溫度：300 ℃；碎片電壓：120 V。實驗數(shù)據(jù)用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2軟件處理。

2.4 結(jié)果

2.4.1 定性分析(質(zhì)譜測定) 取供試品梔子水溶液，注入質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000，進(jìn)行MS測定。測得質(zhì)譜圖中主要峰的質(zhì)量電荷比分別為410.9 m/z,amu、572.7 m/z,amu和426.9 m/z,amu，見圖1。

分別取對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷溶液注入質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000，進(jìn)行MS測定。測得對照品京尼平苷(分子量388.1)和京尼平龍膽二糖苷(分子量550.2)的質(zhì)量電荷比分別為410.8 m/z,amu(M+Na=388.1+22.7 )和572.9 m/z,amu(M+Na=550.2+22.7)，見圖2 A、B。對照品的準(zhǔn)離子峰進(jìn)行MS/MS測定，二級質(zhì)譜碎片離子中分別測得質(zhì)荷比(22.8±0.5)m/z,amu的離子(圖略)，推斷為Na離子。

圖1 梔子提取液質(zhì)譜總離子流

圖2 對照品質(zhì)譜

2.4.2 定量分析(液相色譜) 取供試品梔子水溶液，京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合對照品溶液各0.5μL注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行HPLC-MS測定。供試品色譜圖中峰1、峰2和峰3的保留時間分別為15.23min、14.16min和11.71min(圖3A)，其中峰1和峰2與對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時間完全吻合(見圖3B)。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的溶液，用超純水配制分別為0.1、1、5、50、100 mg·mL-1等不同濃度的對照品溶液，每個濃度平行進(jìn)樣測定3次。以對照品濃度C(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以色譜峰峰面積Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的直線回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)分別為：

Y=22863X-1045.2 r=1.000 00

Y=18471X-3431.9 r=0.999 98

圖3 對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合溶液HPLC圖譜

京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，分析方法學(xué)效能指標(biāo)滿足定量分析方法驗證要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，照“2.3”項下分別于制備后0、2、4、6、8、10、12h 進(jìn)樣0.5μL。結(jié)果京尼平苷的平均峰面積為68 500，RSD為 0.21%，京尼平龍膽二糖苷的平均峰面積為7 417，RSD為 1.22%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取供試品溶液，每次進(jìn)樣0.5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。測得京尼平苷平均峰面積的RSD為 0.18%，京尼平龍膽二糖苷平均峰面積的RSD為 0.70%。表明本辦法精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

按“2.3”項下方法平行制備梔子供試品溶液6份，分別進(jìn)樣0.5μL，測定色譜峰面積，用外標(biāo)法計算含量，求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的平均含量(n=6)分別為4.84%，RSD為0.96%和1.20%，RSD為0.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加標(biāo)回收率

精密吸取供試品溶液，分別添加1.0ppm濃度的對照品混合溶液，進(jìn)樣0.5μL進(jìn)行測定。每個添加水平測定5次，京尼平苷的平均加樣回收率和RSD分別為 109.13%和0.30%；京尼平龍膽二糖苷的平均加樣回收率和RSD分別為94.49%和0.31%。

2.10 含量測定

按“2.3”項下方法制備梔子的供試品溶液6份，分別精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各0.5μL，注入HPLC

儀，測定色譜峰峰面積，外標(biāo)法計算含量，測得京尼平苷平均含量為4.842%，RSD為0.96%；京尼平龍膽二糖苷平均含量為1.1976%，RSD為0.47%。

3 討論

本實驗對樣品進(jìn)行水、甲醇和甲醇-水混合溶液(50∶50)等不同溶劑進(jìn)行提取，對比結(jié)果表明水提取液測得成分含量較高。分光光度計進(jìn)行200～650nm波長掃描，對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的最大吸收峰分別為238nm和239nm，因此后續(xù)試驗采用240nm檢測波長進(jìn)行兩種成分同時檢測。液相色譜柱子分別使用C18和C8柱子，均能測得樣品的活性成分，但C8柱子更能提高效率，故選擇C8柱子。

生藥提取液是包含多個化學(xué)成分的極其復(fù)雜的混合物。色譜法很難同時檢測其所有化學(xué)成分。質(zhì)譜檢測器可以很好地解決這個問題，它對生藥的多種成分均能夠檢測。本文采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所建立的生藥梔子中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷含量測定方法高效、準(zhǔn)確、全面地評價其活性成分，在生藥研究及質(zhì)量控制方面是一個可行的方法。

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(責(zé)任編輯：王尚勇)

2014-01-26

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目(2011MS0204)；室蘭工業(yè)大學(xué)重點研究項目(國際合作)

嘎拉沁·滿都拉(1968-)，男，蒙古族，工學(xué)博士，內(nèi)蒙古師范大學(xué)講師，研究方向為蒙藥、天然藥化學(xué)成分。

巖佐達(dá)郎，日本室蘭工業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。

R284.1

A

1673-2197(2014)08-0027-03