GC-MS對(duì)非釀酒酵母菌發(fā)酵赤霞珠葡萄酒香氣成分的檢測(cè)

徐亞男，劉秋萍，李 琦，王 月，單春會(huì)，肖 婧，史學(xué)偉*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒發(fā)酵前期存在大量非釀酒酵母[1]，與釀酒酵母相比，非釀酒酵母能產(chǎn)生和分泌多種胞外酶[2]：膠質(zhì)酶可增加葡萄汁的提取，促進(jìn)酒的澄清；β-葡萄糖苷酶是水解的非揮發(fā)性的糖苷香氣物質(zhì)前體；蛋白酶能增加澄清；酯酶是重要的發(fā)酵香氣成分；脂肪酶能分解葡萄酒中或酵母自溶的脂肪。這些酶與葡萄汁相互作用，產(chǎn)生不同的品種和發(fā)酵香氣[3]。國(guó)內(nèi)研究非釀酒酵母對(duì)葡萄酒香氣成分影響的報(bào)道較少[4]。此外，在我國(guó)還未形成利用芳香成分作為評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量的系統(tǒng)[5]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，香氣成分鑒定技術(shù)趨于成熟，芳香成分將成為葡萄酒評(píng)價(jià)的一個(gè)重要組成部分。因此，準(zhǔn)確的分析檢測(cè)葡萄酒中各種香氣物質(zhì)組成對(duì)葡萄酒感官特點(diǎn)的改善及釀造工藝的控制具有積極的意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期在新疆葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中采集大量酵母菌，通過(guò)26S rRNA測(cè)序得到19株非釀酒酵母菌，選擇其中發(fā)酵能力較強(qiáng)的7株與工業(yè)菌株混合發(fā)酵新疆赤霞珠干紅葡萄酒，對(duì)其香氣成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以期確定該品系的香氣特點(diǎn)、釀酒性能，選育出優(yōu)質(zhì)非釀酒酵母菌，為生產(chǎn)釀造出具有地域特色的葡萄酒提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄樣品：新疆赤霞珠葡萄。

非釀酒酵母菌株Y2（Galactomycessp.）、Y3（Rhodotorulasp.）、Y5（Candidasp.）、Y10（Hanseniasporasp.）、Y13（Meyerozymasp.）、Y16（Pichiasp.）、Y19（待進(jìn)一步鑒定）均由本實(shí)驗(yàn)室保藏，經(jīng)26S rRNA測(cè)序，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1。

工業(yè)菌株：D-254、L-2323 購(gòu)自澳大利亞瑪麗酵母有限公司。

試驗(yàn)所用試劑及藥品均為試劑純、分析純，購(gòu)自新疆沃德生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS3100型氣相色譜質(zhì)譜計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀：北京東西分析儀器有限公司；R-200增強(qiáng)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；BILON-650Y型超聲波萃取儀：上海比朗精密儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司；pHS-3b型精密pH計(jì)：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄汁預(yù)處理

采自新疆葡萄產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄，經(jīng)去梗破碎成汁，加熱至70 ℃保持20 min，冷卻至室溫后重復(fù)操作連續(xù)3 d，以消除自然微生物的影響[6]。

1.3.2 混合發(fā)酵葡萄酒

以本實(shí)驗(yàn)室前期研究非釀酒酵母菌與工業(yè)菌株混合發(fā)酵的最佳工藝發(fā)酵葡萄酒。

1#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y2，20 ℃發(fā)酵54h后接入工業(yè)菌株D-254，25 ℃混合發(fā)酵，接入比例為1∶3，總接種量為0.08%，發(fā)酵120h結(jié)束，裝瓶；2#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y3，其他條件與1#酒樣相同；3#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y5，其他條件與1#酒樣相同；4#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y19，其他條件與1#酒樣相同；5#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y13，其他條件與1#酒樣相同；6#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y16，其他條件與1#酒樣相同；7#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y10，其他條件與1#酒樣相同；8#酒樣：工業(yè)菌株D-254，活化后25 ℃發(fā)酵，接種量為0.08%，發(fā)酵120h結(jié)束，裝瓶；9#酒樣：新疆某葡萄酒廠剛發(fā)酵的成品酒，發(fā)酵菌株為L(zhǎng)-2323。

1.3.3 酒樣預(yù)處理[7]

取50 mL酒樣加入100 mL具塞錐形瓶中，用移液槍吸取20 μL 2-辛醇（l.000 969 g/L）酒精溶液（內(nèi)標(biāo)物），稱(chēng)取2 g MgSO4，吸取20 mL二氯甲烷，用封口膜快速完成密封隔絕空氣；具塞錐形瓶放置在可控溫的磁力攪拌器上的冰浴里，溫度控制在0 ℃完成攪拌萃取（500 r/min）l h后混合液經(jīng)超聲波萃取15 min（25 ℃），收集有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2 mL，氮吹至l mL，供GC/MS上機(jī)分析。

1.3.4 色譜條件[8]

進(jìn)樣口溫度260 ℃，柱溫箱起始溫度60 ℃，保留時(shí)間2.5 min，6 ℃升至240 ℃，保留15 min；載氣為He，恒流1 mL/min；分流比80∶1。質(zhì)譜條件：電離方式電子電離源（electron ionization，EI），電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，連接桿溫度260 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理[9]：獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果表示3次測(cè)定的平均值。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)反復(fù)進(jìn)行方差分析，顯著性差異通過(guò)T檢驗(yàn)計(jì)算；

香氣成分定性分析[10]：采用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)自帶的NIST 2.0和Wiley譜庫(kù)檢索定性，各香氣物質(zhì)組分的質(zhì)譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索，結(jié)合解析譜圖，確定香氣物質(zhì)；

香氣成分定量分析[11]：采用內(nèi)標(biāo)法，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物對(duì)葡萄酒香氣成分進(jìn)行定量分析，計(jì)算出香氣物質(zhì)的含量。計(jì)算公式[12]：

式中：設(shè)f=1，內(nèi)標(biāo)濃度為100%

2 結(jié)果與分析

2.1 26S rRNA測(cè)序結(jié)果

試驗(yàn)所用菌株的26S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析見(jiàn)圖1。

圖1 26S rRNA 基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 26S rRNA gene sequence phylogenetic analysis of yeast strains

2.2 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

1#～9#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖見(jiàn)圖2～圖10。

圖2 1#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1#wine aroma components

圖3 2#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of 2#wine aroma components

圖4 3#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of 3#wine aroma components

圖5 4#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of 4#wine aroma components

圖6 5#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of 5#wine aroma components

圖7 6#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of 6#wine aroma components

圖8 7#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of 7#wine aroma components

圖9 8#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of 8#wine aroma components

圖10 9#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.10 GC-MS total ion chromatogram of 9#wine aroma components

2.3 NIST譜庫(kù)檢索分析

對(duì)檢測(cè)到的化合物通過(guò)NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索，選取匹配度大于800以上的所有化合物，9種酒樣中共檢測(cè)到16種物質(zhì)，其中酯類(lèi)物質(zhì)7種，醇類(lèi)6種，其他香氣物質(zhì)3種（見(jiàn)表1）。

由表1可知，檢測(cè)到赤霞珠葡萄酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇、1-己醇、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、3-羥基丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯。

以Y10（Hanseniasporasp.）孢漢遜酵母屬發(fā)酵的7#赤霞珠葡萄酒的主要優(yōu)勢(shì)特征香氣較其他組分略高，尤其是己酸乙酯高于工業(yè)菌株D-254發(fā)酵8#葡萄酒；乙酸己酯、糠醛高于成品酒9#。說(shuō)明非釀酒酵母菌與工業(yè)菌株混合發(fā)酵方法可行，可以在一定程度上提高葡萄酒的香氣成分。

2.4 主要香氣成分分析

（1）醇類(lèi)：主要來(lái)源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化[13]，本次試驗(yàn)檢測(cè)到醇類(lèi)物質(zhì)6種，試驗(yàn)中所有酒樣的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇相對(duì)含量較高，苯乙醇具愉快的玫瑰花香、薔薇香氣、茉莉香、丁香、花粉味；2-甲基-1-丙醇相對(duì)含量也較高，具青草、植物香氣。說(shuō)明在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母發(fā)酵使醇類(lèi)化合物大量生成，最終構(gòu)成了葡萄酒的香氣成分。

（2）酯類(lèi)與內(nèi)酯類(lèi)：葡萄酒中的酯類(lèi)主要來(lái)源于3種途徑[14]：存在于葡萄漿果果皮中的構(gòu)成果香的酯類(lèi)；在發(fā)酵過(guò)程中由酵母菌和細(xì)菌活動(dòng)形成的酯類(lèi)；在貯藏過(guò)程中由酯化反應(yīng)形成的酯類(lèi)。本次試驗(yàn)共檢測(cè)到酯類(lèi)物質(zhì)7種，辛酸乙酯含量最高，具青蘋(píng)果味、果香、草莓香、茴香味，有益于葡萄酒的香氣質(zhì)量；己酸乙酯具有果香、青蘋(píng)果味、香蕉味、白蘭地味；癸酸乙酯具有白蘭地味、果香、葡萄香。其構(gòu)成了葡萄酒的主要香氣特征。

（3）在酒精發(fā)酵中生成的有機(jī)揮發(fā)酸，主要是乙酸、戊酸和異戊酸以及每升幾百毫克的己酸、辛酸及葵酸等。其他酮類(lèi)、酚類(lèi)和醚類(lèi)化合物在9種酒樣中均未檢測(cè)到。

3 結(jié)論

以不同非釀酒酵母菌株與工業(yè)菌株混合發(fā)酵赤霞珠葡萄酒，GC-MS分析其香氣成分，結(jié)果表明，非釀酒酵母菌株與釀酒酵母菌株混合發(fā)酵，可以把漿果中的中性化合物轉(zhuǎn)化為芳香化合物[6]，增加酒的香氣成分，進(jìn)而增加酒的感官特性。

葡萄酒香氣是葡萄酒品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[13]，近年來(lái)，葡萄酒香氣成分的研究呈上升趨勢(shì)，到目前為止，已經(jīng)被鑒定存在于葡萄酒中具有揮發(fā)能力的化學(xué)物質(zhì)大約在1 000種以上[13]，可劃分為醇類(lèi)物質(zhì)、酯類(lèi)物質(zhì)、酸類(lèi)物質(zhì)等九大類(lèi)，這些香氣物質(zhì)在同一葡萄酒環(huán)境中通過(guò)相互作用構(gòu)成了每種葡萄酒獨(dú)有的香氣類(lèi)型。而在本次試驗(yàn)中，香氣成分檢測(cè)較少，試分析原因如下：

（1）葡萄酒是十分復(fù)雜的酒精飲料[14]，香氣成分種類(lèi)繁多，一些成分含量極低，很難被檢測(cè)到，另一些成分極其不穩(wěn)定，在分離提取時(shí)容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。因此，分析葡萄酒香氣成分是一項(xiàng)復(fù)雜的研究工作。由于香氣成分極低的物質(zhì)必須在高度富集的條件下才能被檢測(cè)到；另外在葡萄酒的香氣分離提取過(guò)程中會(huì)人為添加一些非原葡萄酒具有的香氣或者一些其他有機(jī)雜質(zhì)，這部分香氣或有機(jī)物質(zhì)可能會(huì)在GC-MS分析圖譜圖中覆蓋或者影響葡萄酒中原有的一些香氣成分；

（2）本試驗(yàn)樣品為發(fā)酵剛剛結(jié)束酒樣，此時(shí)酒體粗糙、酸澀，飲用質(zhì)量較差，通常稱(chēng)之為生葡萄酒[15]，此時(shí)香氣成分較少，不易檢測(cè)。必須經(jīng)過(guò)一系列的物理、化學(xué)變化后，才能達(dá)到最佳飲用質(zhì)量；本次試驗(yàn)在對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，應(yīng)以陳釀成品酒作對(duì)照，李記明等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄揮發(fā)性香氣物質(zhì)不僅有明顯的品種差異，而且有典型的年份特征；

（3）香氣成分預(yù)處理，本試驗(yàn)所用方法為液液萃取，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑具有同時(shí)萃取葡萄酒中的高、中、低濃度香氣物質(zhì)的能力[17]。但是萃取液經(jīng)過(guò)蒸餾和濃縮，也許會(huì)導(dǎo)致一部分香氣物質(zhì)的降解或形成一些新的物質(zhì)，從而影響葡萄酒香氣分析的準(zhǔn)確性。

后期研究的重點(diǎn)是分析不同陳釀時(shí)間、不同樣品處理方式對(duì)葡萄酒香氣成分的影響，研究其具體的特征香氣以及形成機(jī)理。

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