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      高速逆流色譜(鹽溶液體系)分離制備白芍中的芍藥苷

      2014-04-23 01:29:14劉浩杭偉周曉晶陳義倫王曉段文娟
      山東科學(xué) 2014年3期
      關(guān)鍵詞:粗提物逆流正丁醇

      劉浩,杭偉,周曉晶,陳義倫,王曉,段文娟*

      (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018;2.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心,山東省分析測試中心,山東 濟南 250014;3.北京理化分析測試中心,北京 100089)

      白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根,具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效。用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛和頭痛眩暈等癥狀[1]。芍藥苷是白芍中的主要活性成分,具有抗炎、止痛、抗風(fēng)濕、保護肝臟等功效,且具有一定的抗癌作用[2-3]。臨床上芍藥苷制劑被廣泛地應(yīng)用于治療心腦血管、肢節(jié)痛疼等疾病。

      目前報道的芍藥苷的制備主要采用大孔樹脂、硅膠柱色譜和高效液相色譜等方法[4-6],但這些方法存在耗時長、溶劑消耗大、容易造成樣品的不可逆吸附、變性及樣品回收率低等缺點,利用傳統(tǒng)分離方法,不能對其進行快速有效的分離。因此,建立一種快速分離制備芍藥苷的方法非常必要。

      高速逆流色譜技術(shù)是一種建立在特殊的流體動力學(xué)平衡基礎(chǔ)上的液-液分配色譜技術(shù),不會出現(xiàn)固態(tài)支撐材料對樣品和分離結(jié)果的不可逆吸附、干擾、污染、失活及變性等不良影響。而且,因為分離柱內(nèi)沒有固態(tài)填料占體積,容易實現(xiàn)較大的進樣量和制備量;不含價格不菲的填料,所以制備的成本低[7-8]。常用于高速逆流色譜的溶劑體系為氯仿-甲醇-水、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水以及正丁醇-水等,這些溶劑體系適用于分離純化中等極性的化合物,對于一些高極性的糖苷類成分,很難達到理想的分離效果。本文將鹽水體系應(yīng)用于高速逆流色譜技術(shù),對白芍中的芍藥苷進行分離、純化,建立了一種快捷、簡單的芍藥苷制備方法,為高極性化合物的分離純化提供參考。

      1 實驗部分

      1.1 儀器

      GS10A型高速逆流色譜儀(北京艾美林科技有限公司)、TBP泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3 mm,分離體積300mL,β值為0.5~0.8)、8823B-紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)、3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司);Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng) (Waters-600溶劑輸送泵,Water-996二極管陣列檢測器,Empower工作站,美國Waters公司)。Varian INOVA-600核磁共振波譜儀 (美國Varian公司);Agilent 1100 Series 6320 ion-trap質(zhì)譜儀 (美國Agilent公司)。

      1.2 試劑與材料

      粗提物的制備及HSCCC分離用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和硫酸鈉等試劑均為分析純;高效液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司),水為過濾蒸餾水。

      白芍藥材購自山東省中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院,經(jīng)山東省中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為毛茛科植物芍藥的根。

      1.3 溶液的配置

      分別稱取30 g和50 g Na2SO4,于室溫下溶于1000mL純水中,超聲使Na2SO4完全溶解。KH2PO4同樣按上述方法配制濃度為5%的溶液。

      1.4 芍藥苷粗品的制備

      取白芍藥材500 g,加入8倍量75%的乙醇加熱回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮得浸膏112.65 g,加2 L水混懸后,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯分別萃取3次,水相減壓濃縮得芍藥苷粗提物81.47 g,供高速逆流色譜分離用。

      1.5 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

      本實驗所用的溶劑體系為正丁醇-乙酸乙酯-5%Na2SO4溶液(4:1:5,V/V),按比例配置2 L于分液漏斗中,劇烈振蕩使充分混合,于室溫靜置分層。分出上下相,使用前超聲脫氣15 min備用。

      取芍藥苷粗提物100mg,加入上下相各2 mL,振蕩使其完全溶解,用于HSCCC分離。

      1.6 分配系數(shù)(KD)的測定

      分配系數(shù)的測定按文獻[9-10]中的方法,分別量取已經(jīng)平衡好的溶劑體系中2 mL上相和2 mL下相置于試管中,加入少量芍藥苷粗提物,充分振搖,靜置分層,分別取20 μL上、下相的溶液,用HPLC進行檢測。以上相組分峰面積(AU)與下相組分峰面積(AL)的比值來計算樣品在該溶劑體系中的分配系數(shù)KD。

      1.7 HSCCC法分離制備過程

      將已超聲脫氣的上相(固定相)以20mL/min流速泵入HSCCC螺旋管中,待上相充滿整個螺旋管,打開主機,使高速逆流色譜儀螺旋管柱按照順時針的方向旋轉(zhuǎn),當(dāng)轉(zhuǎn)速達到800 r/min時,以2.0mL/min流速將下相(流動相)泵入高速逆流色譜儀,待流出的上相體恒定后即平衡完畢,進樣,紫外檢測波長為254 nm,根據(jù)記錄信號的出峰情況分別收集流出液。收集的溶液通過HPLC檢測,合并目標成分。

      1.8 HPLC 分析條件

      色譜柱:Intersil ODS-SP(4.6 mm ×250mm,5 μm);流動相:A 為甲醇,B 為0.2%冰乙酸溶液。梯度洗脫程序為0~20min,5% ~100%A;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 HSCCC分離條件的優(yōu)化

      逆流色譜作為分配色譜,樣品分離的必要條件是選擇適合目標成分的溶劑系統(tǒng),溶劑系統(tǒng)的選擇可通過測定分配系數(shù)KD來確定。在HSCCC分離過程中,最合適的KD值范圍是0.5~2。若KD<0.5,出峰時間太快,組分峰之間的分離度較差,達不到分離目的。當(dāng)KD>2時,出峰時間較長,且峰形變寬,分離效率太低。而當(dāng)0.5<KD<2時,目標成分通??梢栽诤线m的時間出峰,并能得到較好的分離效果[11]。

      應(yīng)用高速逆流色譜分離高極性化合物通常采用的溶劑體系為正丁醇-水體系[12]。但是,當(dāng)目標化合物的極性過高時,即使采用正丁醇-水體系也很難達到滿意的分離效果,這是由于化合物極性高,在兩相溶劑的分配中主要在下相,KD值偏小,分離效果差。當(dāng)在水相中添加適量的無機鹽時,由于無機鹽改變水溶液的離子強度,使目標化合物在有機相中的溶解度增大,提高KD值,從而達到理想的分離效果。本實驗測定了目標化合物在乙酸乙酯-正丁醇-Na2SO4和乙酸乙酯-正丁醇-KH2PO4溶劑體系中的KD值,結(jié)果見表1。當(dāng)采用正丁醇-乙酸乙酯-5%KH2PO4(4:1:5,V/V)為兩相體系時,KD值為0.25,小于0.5,目標化合物與雜質(zhì)一起被洗脫出來,無法達到理想的分離效果。改變鹽的種類,將KH2PO4換成Na2SO4。若采用正丁醇-乙酸乙酯-3%Na2SO4(3:2:5,V/V)為兩相容積體系時,KD值為0.17,小于0.5,也無法達到理想的分離效果。通過降低橋溶劑的比例,將體系改為正丁醇-乙酸乙酯-3%Na2SO4(4:1:5,V/V),KD值增加到0.47,但是,分離效果還是較差,無法得到高純度的目標化合物。調(diào)整Na2SO4的濃度,增大下相中的離子強度,增加目標化合物在上相中的分配,KD值為0.61,在0.5~2的范圍內(nèi),適合HSCCC分離。故采用正丁醇-乙酸乙酯-5%Na2SO4為HSCCC分離芍藥苷的溶劑體系。本實驗還對流動相的流速進行了優(yōu)化,當(dāng)流動相的流速較大時,分離效果差;流速較小時,分離時間過長。最后確定流速為2 mL/min,既節(jié)約時間和溶劑,又能達到良好的分離效果。

      表1 樣品在不同溶劑體系中的KD值Table 1 KDin different solvent systems

      2.2 HSCCC 分離

      以正丁醇-乙酸乙酯-5%Na2SO4(4:1:5,V/V)為兩相溶劑體系,按照1.5節(jié)所述的方法對芍藥苷粗提物進行分離純化。稱取100mg粗提物于試管中,分別加入2 mL的上、下相,充分振搖后進行HSCCC分離,從100mg待分離樣品中一次性得到56.13 mg化合物I。HSCCC圖見圖1。

      圖1 芍藥苷粗提物的高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of the crude extract of paeoniflorin

      2.3 HPLC分析條件優(yōu)化及結(jié)果

      分別考察了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.2%乙酸溶液作為流動相時的分離情況,結(jié)果表明,當(dāng)流動相為甲醇-0.2%乙酸溶液時分離效果良好,因此本實驗采用甲醇-0.2%乙酸溶液為流動相。

      取適量的芍藥苷粗提物、HSCCC分離后的餾分I,用甲醇(色譜純)溶解并過0.45 μm濾膜后,經(jīng)HPLC分析,圖2為相應(yīng)的HPLC圖。圖2A是芍藥苷粗提物甲醇溶液的HPLC圖,圖2B是HSCCC分離后餾分I的HPLC圖。可見樣品在粗提取后依舊有很多雜質(zhì),經(jīng)HSCCC分離后,得到了高純度的化合物I。采用面積歸一法,測得化合物I的純度在98%以上。

      圖2 HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the samples

      2.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

      化合 物 I:ESI-MS(positive),m/z:503[M+Na]+。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.04(2H,d,J=7.2 Hz,H-2″,6″),7.68(1H,t,J=7.2 Hz,H-4″),7.55(2H,d,J=7.2 Hz,H-3″,5″),5.35(1H,s,H-9),4.96(1H,d,J=4.8 Hz,H-1′),4.41(2H,s,H-8),3.68(1H,d,J=8 Hz,H-6′),3.0-3.6(m,HGlc),2.46(1H,d,J=6 Hz,H-5),2.38(1H,dd,J=10.6 Hz,H-7β),2.09(1H,d,J=12 Hz,H-3β),1.83(1H,d,J=10.6 Hz,H-7α),1.68(1H,d,J=12 Hz,H-3α),1.31(3H,s,H-10);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ 88.1(C-1),85.5(C-2),44.1(C-3),105.2(C-4),42.7(C-5),70.7(C-6),22.4(C-7),61.7(C-8),100.6(C-9),19.6(C-10),99.1(C-1′),73.4(C-2′),77.3(C-3′)70.4(C-4′),77.3(C-5′),61.7(C-6′),130.1(C-1′′),129.8(C-2′′),129.2(C-3′′),133.9(C-4′′),129.1(C-5′′),129.7(C-6′′),166.2(C-7′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致,因此鑒定其為芍藥苷。

      本研究采用正丁醇-乙酸乙酯-5%Na2SO4體系分離純化芍藥中的芍藥苷,具有簡便、快捷、節(jié)省溶劑以及重現(xiàn)性好等特點。而且與Chen等[14]所做的研究相比,本文通過使用添加無機鹽的高速逆流色譜體系,使芍藥苷HSCCC色譜峰與雜質(zhì)HSCCC色譜峰達到了基線分離,因此極大地提高了芍藥苷與粗提物中其他化學(xué)成分在HSCCC分離過程中的分離度。該研究為芍藥中芍藥苷的分離制備提供了一種新型、實用的方法,并且為高極性化合物的HSCCC分離純化提供了新的思路。

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