滋腎平顫顆粒對異動癥大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)紋狀體DAT和VMAT2基因表達(dá)的影響

葉青 周潔 袁燦興

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

滋腎平顫顆粒對異動癥大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)紋狀體DAT和VMAT2基因表達(dá)的影響

葉青 周潔 袁燦興

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

目的：觀察滋腎平顫顆粒對異動癥（levodopa-induced dyskinesias，LID）大鼠行為學(xué)和黑質(zhì)紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運體（dopamine transporter，DAT）及囊泡單胺轉(zhuǎn)運體2（vesicular monoamine transporter2，VMAT2）基因表達(dá)的影響。方法：采用6-羥基多巴胺（6-hydroxydopam ine，6-OHDA）注射于大鼠腦右側(cè)黑質(zhì)造成偏側(cè)帕金森?。≒arkinson's disease，PD）模型，進(jìn)一步對PD大鼠予以左旋多巴/芐絲肼制作異動癥模型。實驗設(shè)立正常對照組、模型組、中藥干預(yù)組、中止給藥對照組和中止給藥+中藥干預(yù)組，分別處理或給藥1個月后觀察藥物對LID大鼠異常不自主運動（abnormalinvoluntary movement，AIM）評分的影響，運用實時定量PCR檢測黑質(zhì)紋狀體DAT及VMAT2 mRNA表達(dá)。結(jié)果：與模型組和中止給藥對照組比較，中藥干預(yù)可明顯減少異動癥大鼠的AIM積分；熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表達(dá)率明顯低于正常對照組及其他各組，中藥干預(yù)組與模型組，中止給藥+中藥組與中止給藥組比較，兩種mRNA表達(dá)均上調(diào)，其中VMAT2增高的趨勢更明顯。結(jié)論：中藥可以有效緩解異動癥癥狀，上調(diào)DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表達(dá)。

異動癥 滋腎平顫顆粒 行為學(xué) 多巴胺轉(zhuǎn)運體 囊泡單胺轉(zhuǎn)運體2 實驗研究

異動癥是左旋多巴（levodopa，LD）長期治療帕金森病過程中普遍出現(xiàn)的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為舞蹈癥和手足徐動癥，嚴(yán)重影響帕金森病患者的日常生活質(zhì)量。目前，各國學(xué)者在努力尋找帕金森?。≒arkinson's disease，PD）病因的同時將研究重點集中在如下兩方面：一是如何阻止或減緩黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性；二是如何減少左旋多巴制劑毒副作用。本研究主要探討滋腎平顫顆粒對異動癥（levodopainduced dyskinesias，LID）模型大鼠行為學(xué)和黑質(zhì)紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運體（dopamine transporter，DAT）及囊泡單胺轉(zhuǎn)運體2（vesicular monoamine transporter2，VMAT2）基因表達(dá)的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物滋腎平顫顆粒為上海市名中醫(yī)胡建華教授經(jīng)驗總結(jié)方，由熟地黃15g、枸杞15g、桑寄生20g、天麻15g、僵蠶10g、莪術(shù)15g、白芍藥20g、天南星15g、全蝎3g、蜈蚣3g組成，由江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑（批號：0504312）。每袋重4.8g，相當(dāng)于生藥32g。將4袋滋腎平顫顆粒（相當(dāng)于成人l日用量，含生藥128g）混合后溶于100mL生理鹽水中，使每毫升含生藥1.28g。LD粉劑5g（批號：SLD6382）和芐絲肼粉劑5g（批號：SL06492），由美國Sigma公司提供。

1.2 實驗動物成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK滬2003-0002。

1.3 主要試劑和儀器6-羥基多巴胺、阿樸嗎啡（apomorphine，APO），美國Sigma公司產(chǎn)品；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR（F-PCR）反應(yīng)試劑盒，寶生物工程大連有限公司；DEPC，賽百勝公司；大鼠腦立體定位儀，TOW-3A型，第二軍醫(yī)大學(xué)產(chǎn)品；超速離心機，LE80K型，Beckman公司產(chǎn)品；液體閃爍發(fā)光記數(shù)儀，Wallac1450型，美國PerkinElmer公司產(chǎn)品。IQS多色實時定量PCR檢測系統(tǒng)，美國BIO-RAD；Eppendorf核酸蛋白檢測儀，德國產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 PD大鼠模型制備[1]雄性SD大鼠，在1%戊巴比妥（30mg/kg體重）麻醉下，固定于大鼠腦立體定向儀上，參照包新民等[2]所著大鼠腦立體定位圖譜，確定右側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）和中腦腹側(cè)被蓋部（VTA）三維坐標(biāo)位置。SNC：前囟后4.8mm，矢狀縫右側(cè)2.0mm，硬膜下8.0mm；VTA：前囟后4.8mm，矢狀縫右側(cè)1.2mm，硬膜下8.2mm。牙科鉆打孔，向兩坐標(biāo)點各注射6-OHDA 6μg（溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%抗壞血酸的生理鹽水中，濃度為2μg/μL），注射速度為1μL/min，留針10min。術(shù)后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素，待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。術(shù)后2周開始行為學(xué)檢測，應(yīng)用阿樸嗎啡腹腔注射（0.5mg/kg體重），若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞210r/30m in則視為成功PD模型。

2.2假手術(shù)方法用上述同樣方法向右側(cè)SNc和VTA分別注射3μL生理鹽水（僅含0.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗壞血酸），術(shù)后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染。

2.3 LID大鼠模型制備[3]對造模成功的PD大鼠予以左旋多巴/芐絲肼處理（10mg/kg左旋多巴和2.5mg/m L芐絲肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的消毒生理鹽水中），每日10mg/kg，每日2次腹腔注射，連續(xù)4周。根據(jù)其是否出現(xiàn)異常不自主運動（AIM）包括刻板動作和對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，篩選出LID模型（AIM評分＞20分則視LID造模成功）。

2.4 行為學(xué)測試方法（AIM評分測定）各組大鼠均每周1次進(jìn)行AIM評分[4]。腹腔注射左旋多巴/芐絲肼后立即評分，每30m in評定1次，持續(xù)120m in，共有5組數(shù)據(jù)，5組數(shù)據(jù)之和為該次評定結(jié)果。將AIM分為4個部分（前肢、口面部、軸性及運動）進(jìn)行評定，每部分又根據(jù)其有或無及嚴(yán)重程度劃分為五個等級（0～4分）。0分：無；1分：偶爾出現(xiàn)；2分：經(jīng)常出現(xiàn)；3分：持續(xù)存在，刺激使之停止；4分：持續(xù)存在，刺激也不能使之停止。理論上1只大鼠1次用藥后的AIM最高評分為64分。

2.5 動物分組與給藥54只大鼠造模后經(jīng)行為學(xué)測試，成功造模的LID模型大鼠24只，隨機分為模型組、中藥干預(yù)組、中止給藥對照組、中止給藥+中藥干預(yù)組，每組6只。另取6只假手術(shù)大鼠為正常對照組。正常對照組及中止給藥對照組給予生理鹽水灌胃，模型組繼續(xù)予以左旋多巴/芐絲肼腹腔注射（注射劑量為每千克體質(zhì)量10mg），中藥干預(yù)組在模型組處理基礎(chǔ)上給予中藥灌胃，中止給藥+中藥干預(yù)組則在停用左旋多巴/芐絲肼的基礎(chǔ)上加用中藥（同中藥干預(yù)組），每次灌胃量為9mL/kg，1次/d，連續(xù)4周。

2.6 大鼠腦組織抽提RNA步驟大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭處死，冰浴中快速剝離大腦，準(zhǔn)確切取雙側(cè)中腦黑質(zhì)和尾殼核腦組織，用鑷子分別轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加入1mL Trizol勻漿，室溫5～10min，轉(zhuǎn)入doff管中，加0.2mL氯仿，震蕩15min，室溫或4℃靜置15min，4℃12000g（15000r/min）離心15min，上清轉(zhuǎn)入另一doff管，加入0.5mL異丙醇，-20℃靜置15min，4℃12000g（15000r/min）離心10min，去上清，加入1mL 95%乙醇洗滌沉淀，4℃8000g（10000r/min）離心5min，晾干沉淀，加入DEPC水溶解，-20℃保存。

2.7 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成引物，每條引物1OD，用于染色法定量PCR。VMAT2 mRNA：F（CCTTCGAAGTCCA CCTGCTAA）；R（CATCACCGATGGGA TATGACTG）。DAT mRNA：F（GCTGC TACATCGGCATCGAG）；R（GTGCCA GCTGCAAAGTGGTC）。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15min反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；85℃，5s反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)。

2.8 FQ-PCR反應(yīng)條件定量PCR儀測定各組mRNA相對含量。0.05min→95℃，0.05min→Tm，0.2min→72℃，0.1min→72℃，5min（Tm：B-action-STR 61.6℃，B-actionSN 61.4℃，DAT 60.9℃，VMAT2 57.4℃）。按照FQ-PCR間接定量公式計算：平均相對含量（%）=2平均△△Ct，△△Ct=△Ct樣本-△Ct對照，△Ct樣本=△Ct樣本-△Ct內(nèi)參。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠給藥前后神經(jīng)行為學(xué)（AIM評分）的變化見表1。與用藥前（第0周）比較，模型組大鼠用藥后第1、2、3和4周的AIM評分逐步升高。與同期模型組比較，中藥干預(yù)組大鼠第1周AIM評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，自第2周開始下降，第3和4周的AIM評分值明顯降低（P＜0.01）。中止給藥對照組大鼠第2、3和4周AIM評分明顯低于同期模型組（P＜0.01）。中止給藥+中藥干預(yù)組大鼠AIM評分自第2周開始低于同期中止給藥對照組（P＜0.01）。

3.2 各組大鼠治療后損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體DAT、VMAT2 mRNA相對表達(dá)量比較見表2。FQ-PCR結(jié)果計算后經(jīng)由Excel軟件套用公式分析，得到各組大鼠黑質(zhì)紋狀體DAT及VMAT2 mRNA的相對表達(dá)量。從表2可以看出，治療4周后各組大鼠DAT mRNA的表達(dá)量均較正常對照組明顯降低（P＜0.01）；中藥干預(yù)組較模型組，中止給藥+中藥干預(yù)組較中止給藥對照組，DAT mRNA的表達(dá)量均明顯增高（P＜0.01）。模型組、中藥干預(yù)組、中止給藥對照組大鼠VMAT2 mRNA的表達(dá)量均較正常對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），中止給藥+中藥干預(yù)組VMAT2 mRNA的表達(dá)量較正常對照組明顯升高（P＜0.01），中藥干預(yù)組較模型組，中止給藥+中藥干預(yù)組較中止給藥對照組，VMAT2 mRNA的表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠不同時期AIM評分變化情況（±s）

表1 各組大鼠不同時期AIM評分變化情況（±s）

注：與第0周比較，**P＜0.01；與同期模型組比較，△△P＜0.01；與同期中止給藥對照組比較，##P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）第0周模型組第1周6 35.02±3.11第2周第3周38.76±3.61**第4周47.71±10.75**50.38±7.29**53.44±5.34**6 34.18±6.54中止給藥對照組6 33.17±9.59 27.98±8.72 26.60±7.69△△19.40±4.32△△14.38±3.34△△中止給藥+中藥干預(yù)組6 33.26±7.32 27.76±17.02 12.76±6.53##7.05±3.33##4.76±3.05##中藥干預(yù)組37.05±10.45 41.16±7.12 31.19±2.13△△26.19±2.12△△

表2 各組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體DAT、VMAT2 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體DAT、VMAT2 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與中止給藥對照組比較，##P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）DAT mRNA VMAT2 mRNA 0.25±0.02**中藥干預(yù)組6 0.23±0.03**△△0.88±0.16*△△中止給藥對照組6 0.33±0.05**0.43±0.04**中止給藥+中藥干預(yù)組6 0.58±0.13**##1.59±0.26**##模型組60.09±0.01**

4 討論

DAT是位于多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元突觸前膜上的一種膜蛋白，其主要功能是再攝取突觸間隙中的DA進(jìn)入DA能神經(jīng)元，終止DA的神經(jīng)傳遞[5]。Counihan等[6]在PD患者腦內(nèi)也觀察到DAT mRNA在黑質(zhì)致密部的表達(dá)較對照組減少50%，在黑質(zhì)紋狀體通路減少43%，表明DAT是研究PD發(fā)病機制的一個重要的參考指標(biāo)。有體外實驗顯示：左旋多巴不僅對D8細(xì)胞（產(chǎn)生DAT的細(xì)胞）有毒性損害，還能使DAT數(shù)量明顯減少[7]。這一現(xiàn)象在我們的實驗中從mRNA水平得到證實。接受治療的LID模型大鼠，其DAT mRNA的表達(dá)量與正常大鼠比較都有較大程度的下降，模型組表達(dá)量幾乎為零，運用中藥協(xié)同治療后，DAT mRNA的表達(dá)有明顯上升。

VMAT2為DA能神經(jīng)元突觸末稍內(nèi)單胺遞質(zhì)囊泡膜上的轉(zhuǎn)運體，負(fù)責(zé)將DAT轉(zhuǎn)運入細(xì)胞內(nèi)的DA轉(zhuǎn)運入囊泡并調(diào)節(jié)隨后的釋放，VMAT2通過攜帶DA進(jìn)入突觸囊泡和調(diào)節(jié)隨后的釋放而在DA的儲存與釋放中起關(guān)鍵作用。另外，VMAT2對細(xì)胞內(nèi)毒素的清除也起著非常重要的作用，通過將毒物清除入囊泡而防止對神經(jīng)元的毒性作用。Miller等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在PD小鼠紋狀體區(qū)VMAT2結(jié)合位點明顯減少，在黑質(zhì)致密部的mRNA表達(dá)也同樣減少，而且在PD患者的腦內(nèi)也觀察到VMAT2的含量減少，表明VMAT2也是反映PD損害的一個重要指標(biāo)。在LD替代治療過程中，如能適當(dāng)?shù)卦鰪奦MAT2功能或表達(dá)，使外源性LD在腦內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為多巴胺后發(fā)揮最大效應(yīng)，減少用量以減輕其毒副作用。另外可增加多巴胺的釋放，促進(jìn)多巴胺的轉(zhuǎn)運，提高多巴胺的利用率以減少自由基的產(chǎn)生，減輕體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的壓力，減少殘存神經(jīng)元的變性，達(dá)到有效的遠(yuǎn)期治療效果[9]。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，除了VMAT2 mRNA在中止給藥+中藥干預(yù)組中有較高的表達(dá)，甚至超出了正常大鼠的表達(dá)水平之外，其他3組的VMAT2 mRNA表達(dá)量與正常對照組相比均有明顯下降。但較之模型組，中藥干預(yù)組的VMAT2 mRNA表達(dá)也有明顯提高。VMAT2 mRNA檢測的是與檢測DAT mRNA相同的黑質(zhì)紋狀體區(qū)域。相比較之下，我們可以看出，在同樣等級數(shù)的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元中，中止給藥+中藥干預(yù)組VMAT2 mRNA的表達(dá)比例較之DAT mRNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)升高，中藥干預(yù)組的VMAT2 mRNA表達(dá)比例與DAT mRNA的差異也很明顯。從這一結(jié)果我們可以推測，中藥有促進(jìn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)VMAT2的作用。這可以有效地緩解游離DA在胞體中的含量，恢復(fù)多巴胺能神經(jīng)元末梢儲存與釋放多巴胺的能力即緩沖能力，從而緩解異動癥癥狀。

滋腎平顫顆粒是已故上海市名老中醫(yī)胡建華教授基于中醫(yī)理論，并參考民間驗方及中醫(yī)文獻(xiàn)，經(jīng)過數(shù)十年臨床反復(fù)摸索與驗證，提煉出治療帕金森病的經(jīng)驗總結(jié)方。胡教授認(rèn)為，帕金森病的病變部位主要在肝、脾、腎，且以肝、腎為中心，病機為本虛標(biāo)實?！疤摗眲t指肝腎虧損，臟腑功能失調(diào)；“實”則指風(fēng)、火、痰、瘀互結(jié)，蘊塞腦竅。治療當(dāng)以滋補肝腎、通絡(luò)解毒為基本方法。本方標(biāo)本兼治，重用熟地、枸杞、桑寄生滋補肝腎，治“風(fēng)”之由，再用白芍養(yǎng)肝柔肝、熄風(fēng)止痙，天麻平肝熄風(fēng)，僵蠶、全蝎、蜈蚣搜風(fēng)剔絡(luò)，天南星化痰制痙，莪術(shù)破血除瘀。

本實驗結(jié)果表明，中藥可以有效緩解異動癥癥狀，上調(diào)DAT尤其是VMAT2基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元中突觸囊泡轉(zhuǎn)運或轉(zhuǎn)運體在膜上表達(dá)的功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用。DAT功能的改善有利于多巴胺的再吸收利用；保護(hù)VMAT2的功能有利于多巴胺的儲存和再釋放，使多巴胺神經(jīng)元得到保護(hù)，從而可能提高DA利用率，起到治療PD的作用。

[1]巴茂文，劉振國，孔敏，等.左旋多巴誘發(fā)帕金森病大鼠異動癥模型的建立和評價.上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，26（7）：810

[2]包新民，舒思云.大鼠腦立體定位圖譜.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：53

[3]Carman LS，Gage GH，Shults CW.Partiallesion of the substantia nigra：relation between extent of 1esion and rotational behavior. Brain Res，1991，553（2）：275

[4]曹學(xué)兵，孫圣剛，徐巖，等.左旋多巴治療帕金森病誘發(fā)異動癥的實驗研究.中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（6）：505

[5]張克忠，蔣雨平，徐星.Lactacystin對大鼠紋狀體DAT和VMAT2蛋白表達(dá)的影響.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2007，15（2）：143

[6]Counihan TJ，Penney JB.Regional dopamine transporter gene expression in the substantia from control and Parkinson's disease brains.J Neur Neurosurg Psychiatry，1998，65（2）：164

[7]Vermeulen RJ，Wolters EC，Tissingh G et al.Evaluation of[123I] beta-CIT binding with SPECT in controls，early and late Parkinson's disease.Nucl Med Biol，1995，22（8）：985

[8]Miller GW，Erickson JD，Perez JT，et al.Immunochemical analysis of vesicular monoamine transporter protein in Parkinson's disease.Experimental Neurology，1999，156（1）：138

[9]顧兵，張穎冬，胡剛.帕金森病與Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體的相關(guān)性.中國臨床康復(fù)，2004，8（1）：133

R742.5

A

1672-397X（2014）04-0074-03

葉青（1982-），男，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療帕金森病。

袁燦興，ycanxing@hotmail.com

2013-12-23

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金青年項目（81302926）；上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（ZYSNXD-CC-HPGC-JD-003）