ROS介導(dǎo)的JNK信號通路及其對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)

唐錦華綜述，吳 江，連繼勤審校

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅五營，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶400038）

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是生物有氧代謝過程中產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，作為細(xì)胞內(nèi)的一種信號分子，ROS可通過多種途徑激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）。調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬是ROS介導(dǎo)的JNK 信號通路的一個重要功能，其能夠以ROS水平依賴的方式激活細(xì)胞自噬和凋亡。下面本文僅就近年來研究發(fā)現(xiàn)的ROS介導(dǎo)JNK 信號通路激活的主要途徑，以及其對細(xì)胞自噬的作用作簡要綜述。

1 ROS與JNK 信號通路

ROS是一類可以氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的小分子，是生物有氧代謝過程中產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，包括超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）和自由基（超氧化物、羥自由基）等。正常生理狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生被嚴(yán)格控制，且ROS作為一種信號分子參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，而JNK 信號通路就是受ROS調(diào)控的一條重要通路［1］。

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中的一員，能有效地磷酸化c-Jun的氨基末端并激活c-Jun，是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。由于JNK 信號通路可被環(huán)境中的應(yīng)激因素（如電離輻射、滲透壓改變、營養(yǎng)因素撤除、熱休克及活性氧等）激活，因此JNK 又被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）［2］。在細(xì)胞活動過程中，ROS可通過多種途徑激活JNK 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。

2 ROS通過多種途徑激活JNK

2.1 凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）途徑 ASK1在ROS介導(dǎo)的JNK 通路活化過程中起橋梁作用。在MAPK 信號傳遞過程中，ASK1是一個通過磷酸化MKK4 和MKK7、進(jìn)而激活JNK 通路的上游MAPKKK，可被ROS等多種信號所激活［3］。在ROS的作用下，硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）分子上第32位與第35位的半胱氨酸殘基被氧化形成二硫鍵，從而失去對ASK1的抑制作用。游離的ASK1之間可通過N 端和C 端的卷曲螺旋域形成寡聚體，并進(jìn)一步被磷酸化而激活，最終導(dǎo)致JNK 激活［4］。Trx是一種結(jié)合在ASK1蛋白N 端卷曲螺旋域的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。有研究提示在ASK1的C 端卷曲螺旋域也存在一個負(fù)性調(diào)節(jié)因子谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx），Grx可與氧化型谷胱甘肽（GSSG）反應(yīng)形成復(fù)合物（Grx-SSG 及Grx［S-S］），促使Grx與ASK1解離［5］。在Trx和Grx從ASK1解離下來之后，作為ASK1正性調(diào)節(jié)因子的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）和TRAF6可以結(jié)合到ASK1上，組成了一個活化的大分子復(fù)合體，即活化的ASK1信號小體，進(jìn)而激活JNK。研究表明，Trx可以抑制ASK1信號小體的形成，而TRAF2的過表達(dá)則可以抑制Trx與ASK1的相互作用，使ASK1活化并激活JNK［6］。

2.2 Src激酶途徑 Src家族激酶（Src-family kinases，SFKs）目前由LYN、FYN、LCK、HCK、FGR、BLK、YRK、YES和Src等9個成員組成，其中，Src蛋白是目前研究最多的成員。Src廣泛存在于組織細(xì)胞中，通過與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要分子相互作用，調(diào)控細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和死亡等過程。在ROS介導(dǎo)的JNK 信號通路中，Src的缺失將嚴(yán)重抑制JNK 的活化，Src途徑是ROS激活JNK 的信號通路之一。Chen等［7］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞暴露H2O2后15min內(nèi)可觀察到的JNK 通路快速激活，認(rèn)為H2O2可誘導(dǎo)表皮因子受體磷酸化，通過Src依賴性的途徑啟動JNK 的信號通路。在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中，高活性的Src可使Bruton蛋白激酶Btk29A 肽鏈上的551位酪氨酸去磷酸化而活化，同時活化連接蛋白p120ctn，后兩者可通過小G 蛋白Rho1激活JNK［8-9］。

2.3 谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶π（GSTπ）途徑 GSTπ也是ROS介導(dǎo)JNK 活化的另一重要中間分子。最新的研究發(fā)現(xiàn)，兩種單體形式的GSTπ可以通過與JNK 底物活化轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）的直接作用來抑制ATF2的磷酸化，進(jìn)而抑制JNK1或JNK2的激活［10］。H2O2可使原來與JNK 羧基末端結(jié)合的GSTπ寡聚化并從GSTπ-JNK 復(fù)合體上分離下來，從而恢復(fù)被抑制的JNK 活性［11］。

2.4 混合譜系激酶3（MLK3）途徑 MLK3是MAPKKK 家族MLKs亞家族的成員之一，也是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。它通過磷酸化激活MAPK 通路的絲／蘇氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)下游信號通路激活，是連接ROS和JNK 的重要紐帶。Zhao等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，混合譜系結(jié)構(gòu)域樣激酶（MLKL）是RIP3誘導(dǎo)細(xì)胞壞死樣凋亡的重要下游分子，MLKL 的缺失會嚴(yán)重影響JNK 的磷酸化，進(jìn)而降低ROS 對JNK 的激活作用。van den Berg等［13］發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激引起的ROS水平增加可通過c-Jun氨基末端相互作用蛋白1（JIP1）支架復(fù)合體激活小G 蛋白RALA，進(jìn)而調(diào)控JNK 的磷酸化，而MLK3 則是直接激活MKK4并與MKK4組成JIP1支架復(fù)合體的重要分子。

2.5 受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）-TRAF2復(fù)合體途徑 RIP-TRAF2 復(fù)合體途徑是ROS 激活JNK 的又一重要途徑。RIP與TRAF2是TNF與TNF受體1（TNF-R1）結(jié)合后，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、觸發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要信號分子。近年來的研究表明，RIP 和TRAF2可以相互結(jié)合在靶細(xì)胞膜上的脂筏區(qū)，形成一個RIPTRAF2信號復(fù)合體，在ROS的誘導(dǎo)下直接激活JNK 通路［14］。

2.6 抑制絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶（MAPK phosphatases，MKPs）途徑 MKPs的活性是ROS激活JNK 的另一有效途徑。Kamata等［15］的研究表明，細(xì)胞內(nèi)H2O2可以通過氧化MKPs的半胱氨酸殘基而抑制MKPs的活性，被氧化的MKPs很快被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而消除了MKPs對JNK 的抑制作用，導(dǎo)致JNK 通路持續(xù)激活。Hou等［16］進(jìn)一步證實(shí)，ROS介導(dǎo)的MKP 失活就是導(dǎo)致JNK 通路持續(xù)激活的原因。Lornejad-Schfer等［17］在ARPE-19 細(xì)胞中通過光誘導(dǎo)的方法也發(fā)現(xiàn)隨著ROS產(chǎn)生的增加，MKP-1的水平會顯著下降并導(dǎo)致JNK 激活。

3 ROS-JNK 通路對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用

細(xì)胞自噬是細(xì)胞依賴溶酶體途徑對胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的過程，是細(xì)胞清除受損蛋白與細(xì)胞器的重要途徑，通常在饑餓、氧化損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等條件下水平增強(qiáng)［18］。因此，自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，它的作用受到多種因素的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。其中，ROS-JNK 通路就是誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的一條重要通路。

3.1 通過影響B(tài)cl-2磷酸化激活細(xì)胞自噬 研究發(fā)現(xiàn)，JNK1被ROS激活后可直接磷酸化Bcl-2蛋白，使Bcl-2從自噬關(guān)鍵蛋白Beclin 1上解離下來，Beclin 1被活化后可形成Beclin 1-Vps34-PI3K 多蛋白復(fù)合體，從而激活自噬。當(dāng)使用JNK1 的抑制劑或外源性導(dǎo)入磷酸化位點(diǎn)突變的Bcl-2蛋白時，自噬被抑制；而結(jié)構(gòu)性激活JNK1，則會引起B(yǎng)cl-2的多位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致自噬激活［19］。盡管Bcl-2和Bcl-xL 之間具有相似的結(jié)構(gòu)及相同的磷酸化位點(diǎn)，但Beclin 1與Bcl-xL間的結(jié)合能不能受到JNK1介導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)目前仍不清楚［20］。

3.2 通過上調(diào)ATG7激活細(xì)胞自噬 Wang等［21］的研究表明，ROS-JNK 信號通路還可通過Beclin 1 非依賴的方式直接上調(diào)自噬關(guān)鍵基因ATG7與ATG5，激活細(xì)胞自噬。這一激活方式只存在于腫瘤細(xì)胞中，而在良性組織及正常細(xì)胞中不存在。

3.3 通過激活凋亡信號間接抑制細(xì)胞自噬 細(xì)胞凋亡與自噬是細(xì)胞的兩種重要功能，對凋亡與自噬相互作用的研究是當(dāng)前的一個熱點(diǎn)。凋亡可以通過多種途徑抑制自噬的發(fā)生，反之自噬亦可以抑制凋亡。在研究二者發(fā)生機(jī)制的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)信號分子（如JNK、Akt等）在二者信號通路中頻繁交叉出現(xiàn)，提示著凋亡與自噬存在必然的聯(lián)系［22］。ROS通過雙特異性激酶JNKK（包括MKK4、MKK7）激活JNK，而激活的JNK又可以通過轉(zhuǎn)錄因子AP-1促進(jìn)p53、Bax、Fasl、TNF等促凋亡蛋白的表達(dá)。高表達(dá)的促凋亡蛋白如Bax、Bak等作用于線粒體，可促使細(xì)胞色素C釋放入胞漿，細(xì)胞色素C和caspase-9結(jié)合，最終作用于caspase-3，而使caspase-3 活化?；罨腸aspase具有十分重要的作用，它們可以裂解自噬相關(guān)蛋白，裂解的自噬相關(guān)蛋白可進(jìn)入線粒體，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明，Beclin 1 可以被caspase-3裂解產(chǎn)生C端Beclin 1片段，它可進(jìn)入線粒體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，抑制自噬，誘發(fā)凋亡［23］。另外，表達(dá)的Fasl、TNF等配體與細(xì)胞膜上的死亡受體（Fas、TNFR 等）結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（death-inducing signaling complex，DISC），DISC促進(jìn)前體caspase-8裂解，生成活化的caspase-8，caspase-8一方面可以激活細(xì)胞凋亡的下游caspase，啟動凋亡信號，另一方面可以誘導(dǎo)產(chǎn)生c-FLIP、v-FLIP 等物質(zhì)與Atg3結(jié)合，從而抑制Atg3 和LC3 的結(jié)合，抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。用caspase-8的廣譜抑制劑zVAD 處理小鼠L929纖維肉瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，zVAD 可以促進(jìn)這細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，這表明細(xì)胞的凋亡信號受到抑制后，其自噬途徑反而被激活。而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-8可能與ROS的產(chǎn)生及JNK 的激活關(guān)系密切［24］。

3.4 ROS-JNK 通路對自噬的調(diào)節(jié)作用依賴于細(xì)胞內(nèi)ROS水平 ROS-JNK 通路既可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡也可以介導(dǎo)細(xì)胞自噬，其關(guān)鍵在于細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平。適度水平的ROS 可導(dǎo)致JNK 信號短暫激活，通過Beclin1 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加，但還不足以引起細(xì)胞凋亡。但當(dāng)ROS超過一定水平后則會導(dǎo)致JNK 的持續(xù)激活，引起線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［25-26］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，使用冬凌草甲素處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS產(chǎn)生，以及隨之而來的細(xì)胞凋亡的增加和自噬抑制［27］。相反，低水平的ROS則可促進(jìn)自噬、抑制凋亡。在低ROS水平（即基本氧化應(yīng)激）下，JNK 可通過活化Atg7 介導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。研究證明，在基本的氧化應(yīng)激下，敲除自噬相關(guān)基因Atg7 會顯著降低藥物引起的H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞自噬反應(yīng)，而進(jìn)一步的研究提示ROS依賴的JNK 和ERK 的激活均是介導(dǎo)H2O2升高、促進(jìn)自噬水平增加的重要上游調(diào)控機(jī)制［21］。

4 展 望

ROS的產(chǎn)生作為重要的第二信使參與多種生物學(xué)效應(yīng)的啟動，而ROS-JNK 通路作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中備受關(guān)注的一條重要通路，參與了細(xì)胞增殖、分化、存活、死亡（凋亡為主，包括自噬性細(xì)胞死亡）等許多生命過程。在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在著ROS-JNK 通路直接或間接激活或調(diào)控細(xì)胞自噬的復(fù)雜機(jī)制，ROS的水平直接影響了這一過程。至于ROS-JNK 通路作用于自噬的結(jié)果及其對凋亡的影響，目前尚不明確，但最新的研究表明可能與ROS激活JNK 的途徑等關(guān)系密切。總之，ROS介導(dǎo)JNK 信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相當(dāng)繁瑣，不斷深入研究ROS激活JNK 的實(shí)現(xiàn)過程以及ROS-JNK 激活自噬介導(dǎo)細(xì)胞存亡的作用機(jī)制，將有助于闡明與自噬相關(guān)的某些腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更為有意義的研究方向。

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