一株Nsp2蛋白部分氨基酸自然缺失的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離和鑒定

洪紹鋒，韋 瑩，韋苗苗，覃陸英，覃艷然，陳 櫻，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

一株Nsp2蛋白部分氨基酸自然缺失的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離和鑒定

洪紹鋒，韋 瑩，韋苗苗，覃陸英，覃艷然，陳 櫻，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

將RT-PCR檢測(cè)為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）陽性的肺組織碾磨、過濾后接種MARC-145細(xì)胞，在細(xì)胞上連續(xù)傳代，上清傳至第二代后能產(chǎn)生細(xì)胞病變。通過RT-PCR方法可以檢測(cè)到釋放在細(xì)胞上清中PRRSV RNA。間接免疫熒光試驗(yàn)也能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PRRSV N蛋白的表達(dá)，表明該P(yáng)RRSV毒株成功地在MARC-145細(xì)胞中分離，命名為PRRSV NN1396株。對(duì)NN1396 分離株GP5基因進(jìn)行克隆測(cè)序分析，結(jié)果表明該毒株與NCBI登錄的PRRSV GP5核苷酸同源性為62.9%～98.2%，與PRRSV原型毒株VR-2332的同源性為87.9%，與高致病性毒株P(guān)RRSV JXA1同源性為98.0%，通過GP5的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)所分離的PRRSV為北美型PRRSV，且與高致病性PRRSV分布在同一個(gè)小分支上；對(duì)部分nsp2基因的測(cè)序、比對(duì)結(jié)果表明，該部分基因與NCBI登錄的參考序列VR-2332氨基酸同源性為73.0%，與JXA1的同源性為94.8%。NN1396分離株Nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特異的1+29個(gè)氨基酸的缺失，此外，在缺失29個(gè)氨基酸區(qū)域的上游，含有連續(xù)19個(gè)氨基酸缺失。該P(yáng)RRSV毒株的分離和Nsp2蛋白部分序列的缺失鑒定，為下一步研究Nsp2部分氨基酸缺失對(duì)病毒生物學(xué)特性影響奠定基礎(chǔ)。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；GP5；Nsp2部分氨基酸自然缺失

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一種危害嚴(yán)重的接觸性傳染病，俗稱“藍(lán)耳病”。該病于1987年在北美首次爆發(fā)，主要臨床表現(xiàn)為仔豬呼吸困難，體重下降，生長(zhǎng)緩慢及母豬繁殖障礙[1]。根據(jù)遺傳特性的差異, 可將PRRSV 劃分為兩個(gè)基因型（Genotype），即歐洲（1）型（代表株Lelystad virus，LV）和美洲（2）型（代表株VR2332）。前者主要流行于歐洲地區(qū)，而后者主要流行于美洲和亞太地區(qū)。兩者之間基因組差異約40%，同型病毒間的亞型基因組差異也可高達(dá)20%[2,3]。PRRSV是一種有囊膜不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約15 kb，具有5′端帽狀結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾。病毒粒子呈球型，直徑為55～60 nm。蛋白編碼區(qū)包含至少8個(gè)部分首尾重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF）[4]，其中ORF1a和ORF1b編碼病毒的復(fù)制酶蛋白，這些蛋白在病毒基因組的復(fù)制和亞基因組轉(zhuǎn)錄以及拮抗干擾素中起到重要作用[5]。ORF2a、ORF2b、ORF3和ORF4 分別編碼GP2a、GP2b、GP3、GP4等次要結(jié)構(gòu)蛋白。ORF5、ORF6 和ORF7分別編碼病毒主要囊膜蛋白GP5、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N。

Nsp2為PRRSV編碼的最大的病毒蛋白，在各基因型中和同一基因型之間變異很大。北美洲型的HB-2株、BJ-4株、VR-2332 株和CH-1a株，其Nsp2的氨基酸序列同源性為78.3%～88.9%[6]。特別的是，在Nsp2的高變區(qū)，常有氨基酸的缺失或插入，其病毒生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步研究。本研究利用MARC-145細(xì)胞對(duì)從廣西省南寧市某豬場(chǎng)采集的RT-PCR檢測(cè)PRRSV為陽性的組織器官（肺）進(jìn)行病毒分離，分離到1株病毒，并命名為NN1396株。利用RT-PCR方法擴(kuò)增NN1396 株Nsp2、ORF5基因并測(cè)序分析，并發(fā)現(xiàn)該毒株Nsp2中有49個(gè)氨基酸的缺失。

1 材料與方法

1.1 病料、細(xì)胞、菌株病料為采自廣西省南寧市某豬場(chǎng)發(fā)病死亡豬的組織（肺）；MARC-l45細(xì)胞、大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑新生胎牛血清、MEM、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司；TaqMix、dNTPMixture、RnaseInhibitor、M-MLV等均購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。

1.3 PCR引物本研究參考已發(fā)表的HUN株和中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株CH-la株的核昔酸序列，用生物軟件Oligo6.0分別在部分nsp2、ORF5、ORF7基因前后的保守區(qū)設(shè)計(jì)了3對(duì)引物：nsp2-F/nsp2-R、ORF5-F/ORF5-R和N1/N2（見表1）。

表1 本研究設(shè)計(jì)的PRRSV 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PRRSV in this study

1.4 毒株分離及鑒定方法

1.4.1 PRRSV檢測(cè) 將肺組織剪碎研磨，600×g 離心8 min ，取上清液抽提病毒的總RNA，以病毒RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。cDNA在Taq Mix酶的作用下，以N1/N2（表1）為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰、陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4.2 毒株分離 組織研磨成漿液，100×g 離心5 min感染細(xì)胞。MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，待長(zhǎng)到約90%，棄去培養(yǎng)基，用病毒液（組織液）在37℃、5% CO2溫箱孵育1 h，再加2%維持培養(yǎng)基，感染細(xì)胞放在37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)4～7 d，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。當(dāng)CPE達(dá)80%時(shí)，收獲上清，-70℃ 凍存。上清（記作F1）接種正常細(xì)胞，同上連續(xù)傳代，待其收毒時(shí)間穩(wěn)定，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 毒株鑒定

1.4.3.1 RT-PCR 收集的病毒上清液抽提病毒的總RNA，方法同1.4.1。

1.4.3.2 間接免疫熒光 將病毒上清感染單層 MARC-145細(xì)胞，感染后48 h棄去培養(yǎng)基。用冰甲醇固定10 min，1%BSA封閉30 min，用 PRRSV N 蛋白的特異性單抗室溫孵育2 h ，再加入Alexa Fluor 568標(biāo)記羊抗鼠的二抗室溫孵育1 h，PBS洗3遍后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 ORF5基因、部分nsp2基因的擴(kuò)增將已鑒定為陽性的PRRSVNN1396株F2代細(xì)胞毒提取病毒總RNA。取16μLRNA，加入5×buffer（Mg2+）5μL、dNTPMixture（2.5mmol/L）2μL、RNaseinhibitor（40U/μL）0.5μL、反轉(zhuǎn)錄引物1μL、AMV酶（5U/μL）0.5μL，混勻，42℃1h，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 ORF5基因擴(kuò)增 cDNA在Taq Mix酶的作用下，以O(shè)RF5-F/ORF5-R（表1）為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5.2 部分nsp2基因擴(kuò)增 cDNA在Taq Mix酶的作用下，以nsp2-F/nsp2-R（表1）為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性l min，60℃退火l min，72℃延伸l min，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.5.3 ORF5部分nsp2基因序列分析 檢測(cè)為陽性的目的片段進(jìn)行目的基因回收，克隆，測(cè)序。測(cè)序所獲得的基因序列應(yīng)用生物軟件Lasergene、MEGA4.1分析。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的檢測(cè)和病毒分離將陽性病料碾磨，抽提總RNA，通過特異的診斷引物（表1）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該肺臟組織樣品檢測(cè)結(jié)果為PRRSV陽性，目的片段在443 bp左右，與預(yù)期相符（圖1）。將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序分析，通過核苷酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列屬于我們預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增PRRSV片段（數(shù)據(jù)未顯示），表明所檢測(cè)的組織中含有PRRSV。

圖1 PRRSV PCR檢測(cè)Fig.1 Detection of PRRSV by PCR

為了從組織中分離到PRRSV，將碾磨的病料過濾，接種到MARC-145細(xì)胞上，4 d后取細(xì)胞上清200 μL接種到新鮮的MARC-145細(xì)胞上，如此進(jìn)行連續(xù)傳代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種病料上清的 MARC-145 細(xì)胞單層從第 2 代（F2）開始出現(xiàn)CPE，3代后病變趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)為接種 MARC-145 細(xì)胞 48 h 后即可產(chǎn)生明顯 CPE，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，聚集、皺縮，72 h后細(xì)胞呈灶狀脫落，形成空斑。4～5代細(xì)胞與第3代病變相似，細(xì)胞在接毒 48 h 后開始出現(xiàn)CPE（圖2）。

圖2 MARC-145細(xì)胞感染PRRSV分離株后出現(xiàn)的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathic effect of MARC-145 infected with PRRSV isolate

2.2 分離病毒的鑒定為鑒定導(dǎo)致MARC-145產(chǎn)生CPE是否由PRRSV感染引起，我們對(duì)細(xì)胞上清中病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，取感染細(xì)胞的上清進(jìn)行RNA抽提，通過PRRSV診斷引物（表1）進(jìn)行檢測(cè)，也能擴(kuò)增出預(yù)期大小的PCR片段，測(cè)序結(jié)果也表明擴(kuò)增的片段為PRRSV的基因組序列（結(jié)果未顯示）。為確定PRRSV是否在細(xì)胞中復(fù)制，我們用間接免疫熒光（indirect immunofluorescence，IFA）對(duì)細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)行鑒定。對(duì)傳代的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行固定，用PRRSV特異的N蛋白單克隆進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PRRSV分離株感染的 MARC-145 細(xì)胞中有特異熒光產(chǎn)生（圖3A），而未感染的空白對(duì)照細(xì)胞中沒有特異紅色熒光出現(xiàn)（圖3B），由此，簽定所分離到的病毒為PRRSV。

2.3 GP5基因的克隆和遺傳進(jìn)化分析為對(duì)病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，設(shè)計(jì)的ORF5基因引物（引物序列見表1）。對(duì)PRRSV NN1396分離株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出與預(yù)期一致的片段，如圖4所示。對(duì)GP5基因進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果表明其與NCBI上登錄的參考序列相應(yīng)GP5的同源性為62.9%～98.2%，與PRRSV 原型株VR2332的同源性為87.9%，與高致病性PRRSV JXA1株同源性為98.0%。遺傳進(jìn)化表明所分離的PRRSV為北美型PRRSV，如圖6，其與高致病性藍(lán)耳病分布在同一個(gè)小分支上。

圖3 間接免疫熒光檢測(cè)PRRSV分離株Fig.3 Detection of PRRSV isolate by indirectimmun of uorescence(IFA)

2.4 Nsp2高變區(qū)部分氨基酸缺失的鑒定Nsp2蛋白編碼區(qū)是PRRSV變異最大的區(qū)域，為研究nsp2的遺傳變異規(guī)律，我們對(duì)nsp2高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析。通過特異的引物（引物序列見表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖5所示，所獲得的目的基因長(zhǎng)度為739 bp，比預(yù)期片段少了57個(gè)核苷酸，截去引物后，獲得的核苷酸序列為690 bp，核苷酸與NCBI登錄的參考序列對(duì)應(yīng)部分核苷酸序列同源性為81.3%～96.5%；推導(dǎo)編碼230個(gè)氨基酸，推導(dǎo)編碼的氨基酸與NCBI登錄的參考序列對(duì)應(yīng)部分氨基酸同源性為72.6%～94.8%，與VR2332氨基酸同源性為73.0%，與JXA1的同源性為94.8%；NN1396分離株缺失49個(gè)氨基酸，1+29個(gè)氨基酸缺失的位置與JXA1株的一致，此外，NN1396分離株在30個(gè)氨基酸缺失位點(diǎn)之間，還缺失19個(gè)氨基酸，NN1396分離株氨基酸缺失位置如圖7。

圖5 PRRSV分離株的部分nsp2基因擴(kuò)增Fig.5 Amplif ed part of nsp2 of PRRSV isolate by PCR

3 討論

Nsp2是PRRSV編碼的最大的蛋白，它至少含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的CP/OUT結(jié)構(gòu)域、中間的高變區(qū)、跨膜區(qū)和C端的富含半胱氨酸的區(qū)域[7]。Nsp2的半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinse，CP2）具有順式（cis-）或者反式（trans-）的切割活性，介導(dǎo)Nsp2/Nsp3切割。研究表明，Nsp2含有多個(gè)B細(xì)胞表位，這些表位能夠激發(fā)機(jī)體在病毒感染早期產(chǎn)生很高的抗體[8]。2006年我國(guó)爆發(fā)“豬高熱綜合征”，研究表明高致病性PRRSV是導(dǎo)致該“豬高熱綜合征”的主要病原之一。高致病性PRRSV一個(gè)遺傳特征就是在Nsp2高變區(qū)含有1+29個(gè)氨基酸的缺失[9]，2007年，這一高致病性PRRSV開始廣泛流行。然而也有研究表明，30個(gè)氨基酸的缺失與病毒毒力強(qiáng)弱沒有關(guān)系[10]。本研究分離的NN1396毒株，其Nsp2蛋白高變區(qū)除了存在1+29個(gè)氨基酸缺失外，還在29個(gè)氨基酸缺失的上游缺失19個(gè)氨基酸。幾乎所有強(qiáng)毒力毒株如MN184、08RB1、HP-PRRSV等都在Nsp2部位存在缺失，NN1396毒株Nsp2中19個(gè)氨基酸的缺失對(duì)病毒生物學(xué)特性的是否有影響，還需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究中，我們成功分離到一株P(guān)RRSV NM1396株，并鑒定其Nsp2蛋白存在49個(gè)氨基酸的缺失，為進(jìn)一步研究Nsp2氨基酸缺失對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響奠定了基礎(chǔ)。

圖6 NN1396株GP5核苷酸序列與參考株相應(yīng)序列遺傳進(jìn)化樹Fig.6 GP5 of NN1396 genetic evolutionary tree

圖7 NN1396 株部分Nsp2 蛋白序列與參考序列對(duì)比結(jié)果Fig.7 The deduced amino acid sequence comparison of the nsp2 gene between the NN1396 and the reference sequence

參考文獻(xiàn)

[1] Rossow K D. Porcine reproductive and respiratory syndrome[J]. Vet Pathol, 1998, 35(1): 1-20.

[2] Wu W H, Fang Y, Rachel F,et al.A 10 kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b [J].Virology, 2011, 287(1):183-191.

[3] Meng X J. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus: implications for curent vaccine efficacy and future vaccine development[J]. Vet Microbiol, 2000, 74(4): 309-329.

[4] 韋祖樟, 孫志, 袁世山. 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(3): 408-413.

[5] Fang Y, Snijderb E J. The PRRSV replicase: Exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins[J]. Virus Res, 2010, 154(1-2): 61-76.

[6] Shen S, Kwang J, Liu W,et al.Determination of the complete nucleotide sequence of a vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and identification of the nsp2 gene with a unique insertion[J]. Arch Virol, 2000, 145(5): 871-883.

[7] Snijider E J, Wassenaa A L, Spaan W J,et al.The arterivirus nsp2 protease. An unusual cysteine protease with primary structure similarities to both papain-like and chymotrypsin-like proteases[J]. J Biol Chem, 1995, 270(28): 16671-16676.

[8] de Lima M, Pattnaik A K, Flores E F,et al.Serologic marker candidates identified among B-cell linear epitopes of nsp2 and structural proteins of a North American strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Virology, 2006, 353(2), 410-421.

[9] Tian K, Yu X, Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique Hallmark[J]. PLoS One, 2007, 2(6): e526.

[10] Zhou L, Zhang J L, Zeng J W,et al.The 30-aminoacid deletion in the nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence[J]. J Virol, 2009, 83(10): 5156-5167.

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS FIELD STRAIN WITH NATURAL DELETION OF PARTIAL NSP2 PROTEIN

HONG Shao-feng, WEI Ying, WEI Miao-miao, QIN Lu-ying, QIN Yan-ran, CHEN Ying, HUANG Wei-jian, WEI Zu-zhang
(College of Animal Science and Technology ,Guangxi University, Nanning 530005,China)

The lung tissues with Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) RT-PCR positive results were homogenized and inoculated into MARC-145 cells for virus isolation. PRRSV typical CPE was observed at the second passage. PRRSV RNA was detected in supernatants using RT-PCR. PRRSV N protein was conf rmed in inoculate MARC-145 cells. The obtained PRRSV was designated as NN1396. Hypervariable region of GP5 protein was sequenced and analyzed. The GP5 of NN1396 strain shared 62.9% - 98.2% identities with other PRRSV strains. Phylogenetic analysis showed that NN1396 strain belonged to North American genotype and HP-PRRSV. Sequence analysis of partial nsp2 gene showed that NN1396 strain had 81.4% amino acid identity with VR-2332 strain and 96.5% with JXA1. More importantly, NN1396 strain contained a deletion of 19 aa in nsp2 coding region , which was located upstream of29 aa deletion. Characterization of PRRSV NN1396 strain was useful to study the effect of partial gene deletion of nsp2 on its biological activities.

Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(HP-PRRSV); isolation; GP5; natural deletion of partial Nsp2 protein

S852.659.6

A

1674-6422（2014）06-0006-07

2014-04-29

廣西自然科學(xué)基金（桂科自0728015）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31372444）；廣西大學(xué)大學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能和科技創(chuàng)新能力訓(xùn)練基金項(xiàng)目（SYJN20131705）

洪紹鋒，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

黃偉堅(jiān)，E-mail：huangweijian-1@163.com；韋祖樟，E-mail：zuzhangwei@163.com