參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究

林楠 謝慶平 郭恩琪

●基礎(chǔ)研究

參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究

林楠 謝慶平 郭恩琪

目的 探討參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護機制。 方法 30只SD大鼠隨機分為3組，每組10只：缺血再灌注對照組（對照組）、缺血再灌注參麥組（參麥組）采用扎閉股動、靜脈缺血4h，開放再灌注1h制造缺血再灌注模型，并分別于再灌注即刻給予0.9%氯化鈉注射液、參麥注射液4 ml/kg腹腔注射；假手術(shù)組不結(jié)扎股動靜脈，4h后給予0.9%氯化鈉注射液4 ml/kg腹腔注射。腹主動脈取血，予以抗凝離心取上清液，測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）含量。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，對照組T-SOD活性降低，MDA含量升高（P＜0.01）。參麥組T-SOD活性較對照組升高，MDA含量降低，NO及ET-1含量降低（均P＜0.01），而NO/ET-1增大（P＜0.01）。 結(jié)論 參麥注射液可減少骨骼肌缺血再灌注損傷后大鼠機體自由基生成，提高自由基清除酶活性，改善再灌注損傷血管內(nèi)皮功能紊亂，對缺血再灌注損傷有一定的防治作用。

參麥注射液 缺血再灌注損傷 氧自由基 血管內(nèi)皮細

【 Abstract】 Objective To investigate the protective effect of Shenmai injection on skeletal muscle following limb ischemia reperfusion injury in rats. Methods Thirty SD rats were randomly divided into three groups (n=10 in each group):Ischemic reperfusion+NS group（I/R group）,Ischemic reperfusion+Shenmai injection group (SM group)and sham-surgery group（S group）.Ischemic reperfusion were induced by ligation of rat femoral vessels.The plasma T-SOD,MDA,NO and ET-1 were determined. Results As compared with S group,the T-SOD activity in I/R group was significantly lower(P＜0.01)and MDA content was significantly greater(P＜0.01).Compared with I/R group the T-SOD activity in SM group was significantly higher(P＜0.01)and MDA content was significantly lower(P＜0.01).Compared with I/R group，plasma levels of ET-1 and NO in SM group were decreased(P＜0.01)and the NO/ET-1 ratio was increased(P＜0.01). Conclusion Shenmai injection can resist lipid peroxidation of free radicals and protect the endothelial cells,which may be clinically used for the ischemia-reperfusion injury.

【 Key words】 Shenmai injection Ischemia reperfusion injury Oxygen free radicalVascular endothelial cell

缺血再灌注損傷是臨床常見的病理生理過程,創(chuàng)傷組織在重新獲得血液灌注或氧供后，反而加重了組織代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞[1]，其機制復(fù)雜，影響因素多樣。本實驗初步建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型，觀察大鼠肢體缺血再灌注損傷后產(chǎn)生的氧自由基及血管內(nèi)皮細胞相關(guān)指標變化，探討參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護機制，為臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 選用SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體重200～220 g，自由飲水，室溫（25±2）℃，分籠喂養(yǎng)，由浙江省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK（浙）2008-0033]。按照隨機數(shù)字表法分為3組：缺血再灌注參麥組（參麥組）、假手術(shù)組、缺血再灌注對照組（對照組），每組10只。參麥注射液由杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，每支10ml（國藥準字Z330220021，批號：010873）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）ELISA試劑盒購自杭州達文生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 所有動物在實驗前夜停止喂食，不禁水。用10%水合氯醛（0.4ml/0.1kg）腹腔注射麻醉，每3h追加1次（0.2ml/0.1kg）以維持麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定于木板上，腹股溝區(qū)脫毛，常規(guī)消毒。取右下肢腹側(cè)切口,顯露股動脈、靜脈，用無創(chuàng)手術(shù)縫線活結(jié)扎閉股動、靜脈，并用手術(shù)顯微鏡下觀察，確認血流阻斷，將股骨干后方肌群完全切斷，再將肌肉原位縫合，關(guān)閉皮膚。缺血4h后，打開右側(cè)皮膚切口，解除結(jié)扎線，手術(shù)顯微鏡下觀察血流恢復(fù)，管腔內(nèi)無血栓，再灌注成功，縫合皮膚，可以觀察到動脈血流恢復(fù)后手術(shù)鼠爪由暗紫為粉紅。參麥組再灌注即刻，給予參麥注射液4ml/kg腹腔注射[按成人體表面積換算：大鼠（200g）/人（70kg）=0.018/1]；假手術(shù)組不結(jié)扎股動靜脈，4h后給予0.9%氯化鈉注射液4ml/kg腹腔注射；對照組在恢復(fù)血流，即再灌注即刻，給予0.9%氯化鈉注射液、4ml/kg腹腔注射。

1.2.2 檢測指標 參麥組、對照組分別在再灌注1h，假手術(shù)組為5h后的時間點，自大鼠腹主動脈取血,靜置1h，待血清部分析出，置于高速離心機，5 000r/min，10min，予以離心,取上清液，按試劑盒說明書操作檢測T-SOD活力及MDA、NO、ET-1含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，若方差齊，各組間比較采用單因素方差分析；若方差不齊，則采用近似t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠T-SOD活力及MDA含量比較 見表1。

表1 3組大鼠T-SOD活力及MDA含量比較

由表1可見，與假手術(shù)組比較，對照組T-SOD活性降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。而參麥組T-SOD活性較對照組升高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 參麥組與對照組大鼠NO、ET-1及NO/ET-1的比較 見表2。

表2 參麥組與對照組大鼠NO、ET-1及NO/ET-1的比較

由表2可見，參麥組NO、ET-1含量下降，NO/ET-1比值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，目前已意識到氧自由基在其中發(fā)揮著重要的作用。在正常情況下，生物體內(nèi)即有少量的自由基產(chǎn)生，氧自由基的生成與清除維持著動態(tài)平衡，缺血再灌注損傷時，缺血組織或缺血組織再灌注通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多或清除氧自由基能力下降，如TSOD活性下降，氧自由基不但通過對生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化作用引起細胞損傷，而且還能通過脂質(zhì)過氧化分解代謝產(chǎn)物MDA，促使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合反應(yīng)，引起細胞代謝和功能障礙，甚至細胞死亡。生物膜和亞細胞器是脂質(zhì)過氧化作用損傷的主要部位，線粒體在造成損傷時，由于其不能提供足夠的電子起還原作用，因而也可產(chǎn)生更多的自由基，使損傷進一步加劇。

氧自由基化學(xué)性質(zhì)極為活潑，缺血再灌注引起氧自由基爆發(fā)產(chǎn)生，毒性反應(yīng)強烈[2]，氧自由基爆發(fā)性產(chǎn)生，超過了機體捕獲清除的能力，造成一系列損傷，如產(chǎn)生攻擊性生物大分子、激活p38MAKP啟動凋亡[3]，活化磷脂酶A2合成花生四烯酸產(chǎn)生化學(xué)趨化作用和增加Ca2+內(nèi)流等。氧自由基來源包括：中性粒細胞活化途徑、NAD（P）H氧化酶途徑、黃嘌呤氧化酶途徑和NO合酶途徑等[4]。缺血時堆積的大量次黃嘌呤，在黃嘌呤氧化酶的催化作用下形成黃嘌呤，進而轉(zhuǎn)化為尿酸，這一級聯(lián)反應(yīng)過程均有分子氧參與，接受電子，從而產(chǎn)生大量氧自由基。氧自由基損傷是一連鎖反應(yīng)，一旦發(fā)生即可引發(fā)下一環(huán)節(jié)的發(fā)生、發(fā)展，不斷生成新的氧自由基，進一步加重細胞損傷[5]。兩者互相影響，促進再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，其在組織中的含量可反映脂質(zhì)過氧化程度并間接反映了氧自由基對骨骼肌的損害。SOD活力的高低則間接反映了機體清除自由基的能力，測定其活力可反映體內(nèi)抗自由基水平和能力。

本實驗通過復(fù)制大鼠缺血再灌注損傷模型,并給予參麥注射液，觀察其對肢體缺血性再灌注損傷的保護機制。實驗結(jié)果表明：大鼠肢體缺血性再灌注損傷后4 h，自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化過程增強，細胞損傷程度加重，機體清除氧自由基的能力減弱，其機制是：T-SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它可以將超氧陰離子這一脂質(zhì)過氧化的主要自由基歧化為過氧化氫和水，從而清除超氧化物陰離子，保護細胞免受損傷；但體內(nèi)若自由基生成過多，則T-SOD活力下降，清除氧自由基的能力也明顯減弱。而應(yīng)用參麥注射液后，可明顯增強機體清除自由基的能力，減輕組織細胞的損傷。

肢體缺血再灌注損傷發(fā)生過程中血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮重要作用[6]。血管內(nèi)皮細胞能合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，如前列環(huán)素-2（PGI2）、NO、ET、腺苷等，它們可維持血管的舒縮狀態(tài)。ET-1在心血管系統(tǒng)含量最豐富，主要分泌自血管內(nèi)皮細胞。ET-1是已知的作用最強的內(nèi)源性血管收縮劑。ET受體有ETA、ETB兩類，ETA受體存在于血管平滑肌上，被激活后引起血管收縮反應(yīng)；ETB受體存在于內(nèi)皮上，ET作用于該受體通過釋放內(nèi)源性NO或PGI2等參與血管舒張反應(yīng)。有學(xué)者研究ET受體阻斷劑可以改善冠心病患者冠狀動脈內(nèi)皮功能,增加冠狀動脈血流[7]。

生理情況下NO舒張血管、抑制ET收縮血管，且維持動態(tài)平衡，維持著血管正常的舒縮功能。內(nèi)皮釋放的NO對其本身有重要的保護作用，而循環(huán)血中ET含量少且不呈現(xiàn)其強大的縮血管效應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠肢體缺血性再灌注損傷后4 h，血管內(nèi)皮合成和釋放NO相對不足，使其拮抗ET-1作用減弱，致使血管保護作用減弱。應(yīng)用參麥注射液后,血漿中ET-1含量下降，NO/ET的平衡改善，血管的過度收縮狀態(tài)得到緩解，血管阻力減小。

近年來通過大量研究，肢體缺血再灌注損傷的防治已取得了長足的進展,參麥注射液主要含有人參皂苷、人參多糖、甾苷、有機酸等成分,通過減少c-fos基因的表達、調(diào)節(jié)血小板源生長因子（PDGF）、顯著增加Bcl-2基因表達、減少細胞凋亡數(shù)目等[9]，加強機體器官抗應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)和促進機體免疫能。缺血再灌注組織損傷的機制是一個多因素參與的復(fù)雜過程，參麥如何在各發(fā)病環(huán)節(jié)發(fā)揮干預(yù)和調(diào)節(jié)作用,并從整體水平阻斷了其發(fā)生，還有待于作進一步研究。

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Protective effects of Shenmai injection on skeletal muscle following limb ischemia-reperfusion injury in rats

LIN Nan,XIE Qingping, GUO Enqi.
Department of Hand Surgical,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

2013-04-27）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省醫(yī)學(xué)會臨床科研基金項目（2010ZYC-A02）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院手外科

謝慶平，E-mail：xqp1376@hotmail.com