SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及5-氮胞苷對(duì)其的誘導(dǎo)分化作用

鄧麗群 沈法榮 金紅峰 王歡

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及5-氮胞苷對(duì)其的誘導(dǎo)分化作用

鄧麗群 沈法榮 金紅峰 王歡

目的 探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（SD-MSCs）體外分離的方法條件、生物學(xué)特性及5-氮胞苷對(duì)其的誘導(dǎo)分化作用。 方法 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD-MSCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行分析，并通過(guò)成脂肪誘導(dǎo)鑒定，給予5-氮胞苷進(jìn)行誘導(dǎo)分化，通過(guò)免疫組化和蛋白免疫印跡法,觀察其對(duì)超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控的通道蛋白(HCN2）表達(dá)情況。 結(jié)果 SD-MSCs以長(zhǎng)梭形和多角形為主，呈放射狀集落生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，增殖能力比較活躍。成脂肪誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量橙紅色脂滴形成。不同濃度的5-氮胞苷對(duì)SD-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化后，7.5、10、12.5μmol/L5-氮胞苷誘導(dǎo)的HCN2表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度較高，其中10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h的SD-MSCs HCN2表達(dá)強(qiáng)度最高。 結(jié)論 全骨髓貼壁法能夠有效分離純化增殖SD-MSCs，5-氮胞苷能夠誘導(dǎo)其分化為HCN2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 全骨髓貼壁法 5-氮胞苷

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類(lèi)存在于骨髓中的干細(xì)胞，它不僅可以為造血干細(xì)胞（HSC）提供基質(zhì)環(huán)境促進(jìn)HSC增殖，而且也可以在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)拇碳は抡T導(dǎo)分化成不同類(lèi)型的細(xì)胞[1]。5-氮胞苷可以降低細(xì)胞DNA的甲基化水平，進(jìn)而與MSCs向心肌細(xì)胞分化的特異啟動(dòng)基因上的阻遏蛋白相結(jié)合[2]，有可能將MSCs定向分化，甚至有可能分化為具有起搏功能的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)生物起搏的功能。起搏細(xì)胞膜上存在一種超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控的通道蛋白（HCN），其中的HCN2是細(xì)胞是否具有起搏功能的一個(gè)重要的標(biāo)志。因此探尋5-氮胞苷能否誘導(dǎo)分化具有起搏細(xì)胞特性的細(xì)胞意義非常重要。本研究旨在探討5-氮胞苷能否定向誘導(dǎo)MSCs分化為HCN2陽(yáng)性的細(xì)胞及其相關(guān)的轉(zhuǎn)化條件，為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)奠定一定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)4周齡雄性SD大鼠6只，體重約100g，由浙江省醫(yī)科院提供。低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、100U/ml青霉素、鏈霉素及0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、胎牛血清（南美洲Gibco公司），細(xì)胞周期即時(shí)檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），成骨成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），5-氮胞苷（美國(guó)Selleckchem公司），HCN2抗體（美國(guó)Proteintech公司）等。

1.2 方法

1.2.1 SD-MSCs的原代提取分離培養(yǎng) 用10%水合氯醛0.3～0.4ml/100g大鼠腹腔注射麻醉，用75%乙醇浸泡5～10min消毒后，無(wú)菌條件下剪開(kāi)兩側(cè)后肢皮膚及肌肉，取股骨浸泡在裝有含青霉素、鏈霉素雙抗的細(xì)胞生理鹽水（PBS）中。75%乙醇消毒離心管，除去骨表面的肌肉筋膜，放入裝有事先配置好的含血清10%的DMEM的6cm培養(yǎng)皿中，將股骨剪斷，暴露骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，針頭插入骨髓腔內(nèi)，沖洗數(shù)次，并將其反復(fù)在培養(yǎng)皿中吹吸細(xì)胞懸液3～5次，再過(guò)濾到另一個(gè)無(wú)菌皿中，將過(guò)濾過(guò)的細(xì)胞懸液移至10ml離心管中，1 000r/min離心5min，棄上清液，用10%的DMEM將細(xì)胞吹散移至6cm培養(yǎng)皿內(nèi)配至約5ml，置于飽和溫度37℃、pH 7.2，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，48h首次更換細(xì)胞生長(zhǎng)液，以后3～4d更換1次。

1.2.2 SD-MSCs的純化增殖 原代培養(yǎng)約7～10d，待融合至這個(gè)培養(yǎng)皿的80%左右，開(kāi)始傳代，傳代前用不含血清的DMEM輕輕沖洗1～2遍后，加入事先37℃預(yù)熱的含0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液1ml，1～2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變亮后，吸出上清液，加入含血清10%的DMEM終止消化，用槍頭輕輕吹打培養(yǎng)皿至細(xì)胞變?yōu)閼腋顟B(tài)，按1∶2或1∶3傳代（P1），傳代后2d細(xì)胞便可貼壁，3～5d便可繼續(xù)傳代，即可依次得到P2、P3。

1.2.3 SD-MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 分別取上述生長(zhǎng)穩(wěn)定的第4天的P2、P3細(xì)胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液消化后，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含血清10%的DMEM稀釋細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)獲得1×104個(gè)/ml左右的細(xì)胞，接種于24孔板每孔1ml，每天取3孔計(jì)數(shù)取平均值，連續(xù)8d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱軸，建立坐標(biāo)系，描繪生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集培養(yǎng)穩(wěn)定的P2代細(xì)胞，1 500r/min離心5min，棄去上清液，PBS清洗1～2次，保留100μl，保證細(xì)胞數(shù)量＞2×105，取50μl加入試管底部，加入100μl 4℃預(yù)冷的乙醇，與細(xì)胞懸液輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10min固定單個(gè)細(xì)胞；加入RnaseA100μl，輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10min溶解細(xì)胞膜脂質(zhì)；加入150μl碘化吡啶室溫孵育15min避光染色，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

1.2.5 成脂肪誘導(dǎo) 取SD-MSCs P2代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，接種于事先1%明膠包被好的6孔板2個(gè)孔中（1號(hào)孔為A對(duì)照組，2號(hào)孔為B實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組），每孔細(xì)胞數(shù)約為104個(gè)，置入培養(yǎng)箱過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁＞50%，2號(hào)加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液，成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液A、B交替使用，每周更換2次，每次換液時(shí)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，1號(hào)孔每3d換1次含血清10%的DMEM，約3周后對(duì)成脂肪誘導(dǎo)的細(xì)胞行油紅O染色并倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 5-氮胞苷對(duì)SD-MSCs P2細(xì)胞的誘導(dǎo) 6孔板中分別采用濃度為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)2周后做免疫組化及蛋白免疫印跡試驗(yàn)，一抗選用HCN2，觀察分析結(jié)果，結(jié)果示10 μmol/L的5-氮胞苷的培養(yǎng)液陽(yáng)性結(jié)果最高。取SD-MSCs P2細(xì)胞置入5個(gè)6cm培養(yǎng)皿中，均予以10μmol/L的5-氮胞苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h換液，然后分別于換液后第1、3、7、10、14天，細(xì)胞提蛋白，第15天做蛋白免疫印跡試驗(yàn)，一抗選用HCN2，對(duì)免疫印跡條帶通過(guò)OD比值觀察分析其HCN2表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 SD-MSCs的原代提取分離培養(yǎng)結(jié)果 圖1（見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間SD-MSCs的形態(tài)（A：原代培養(yǎng)5d；B：P1培養(yǎng)3d；C：P2培養(yǎng)3d；D：P3培養(yǎng)3 d；×100）

由圖1可見(jiàn)，原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，2～3d后貼壁細(xì)胞明顯增多,逐漸伸展成為長(zhǎng)梭形、多角形，伸出長(zhǎng)短不一，未貼壁的細(xì)胞在換液時(shí)被除去。在原代培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)是以分散的、克隆集落方式增殖。7～10d，相鄰集落融合成片達(dá)80%以上，可按1∶2或者1∶3傳代，傳代之前可以用不含血清的培養(yǎng)液沖洗去掉未貼壁的細(xì)胞，傳代后即得P1細(xì)胞。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞于4～6h開(kāi)始貼壁，24h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，但增殖速度明顯增快,生長(zhǎng)5～7d即融合達(dá)80%以上，方可傳代，依次得到P2、P3，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始呈比較，均一的長(zhǎng)梭形漩渦狀生長(zhǎng)。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 見(jiàn)圖2。

圖2 P2、P3 SD-MSCs的生長(zhǎng)曲線

由圖2可見(jiàn)，傳代后第1～2天細(xì)胞數(shù)目減少（潛伏適應(yīng)期），3～5d細(xì)胞開(kāi)始大量增加（對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期），第6～7天增幅緩慢趨于穩(wěn)定（平臺(tái)期），未出現(xiàn)衰老。

2.3 SD-MSCs的細(xì)胞周期結(jié)果 見(jiàn)圖3。

圖3 P2 SD-MSCs的生長(zhǎng)周期

由圖3可見(jiàn)，SD-MSCs 78.87%處在G1期，5.46%處在S期，3.96%處在G2期，表明SD-MSCs有較強(qiáng)的增殖能力，增殖周期約為5d。

2.4 成脂肪誘導(dǎo)結(jié)果 圖4（見(jiàn)插頁(yè)）。

由圖4可見(jiàn)，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或橢圓形，約3周后油紅O染色，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量橙紅色折光性強(qiáng)的脂滴，大小不一，多呈圓形，部分脂滴相互融合；對(duì)照的未誘導(dǎo)組染色后未見(jiàn)紅染脂滴。

2.5 5-氮胞苷對(duì)SD-MSCs P2細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果 圖5、6（見(jiàn)插頁(yè)）。

圖5 免疫組化結(jié)果圖（A：未用5-氮胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)2周的SD-MSCs；B～F分別為5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h后繼續(xù)培養(yǎng)2周的SD-MSCs；×100）

圖6 免疫印跡條帶（A：濃度分別為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h后，繼續(xù)培養(yǎng)2周后的HCN2免疫印跡結(jié)果；B：A對(duì)應(yīng)的β-actin免疫印跡結(jié)果；C：10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h后，第1、2、7、10、14天的HCN2免疫印跡結(jié)果；D：C對(duì)應(yīng)的β-actin免疫印跡結(jié)果）。

由圖5可見(jiàn)，藥物誘導(dǎo)2周后用7.5、10、12.5μmol/ L5-氮胞苷誘導(dǎo)的細(xì)胞有黃染，其中10μmol/L的細(xì)胞黃染最深。圖6A、B灰度分析的OD比值示，在5-氮胞苷的濃度為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的OD值分別 為 0.033、0.062、0.155、0.626、0.282、0.074；圖6C、D灰度分析的OD比值示，10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h后，第1、2、7、10、14天的OD值分別為0.449、1.333、3.019、4.976、5.811。通過(guò)分析可以發(fā)現(xiàn)7.5、10、12.5μmol/L5-氮胞苷誘導(dǎo)的HCN2表達(dá)陽(yáng)性較強(qiáng)，其中10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h的SD-MSCs HCN2表達(dá)最強(qiáng)。對(duì)10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24h的SD-MSCs HCN2表達(dá)跟蹤培養(yǎng)15d，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

3 討論

MSCs自我復(fù)制能力強(qiáng)，具有高度的增殖能力，體外基因轉(zhuǎn)染率高及多向分化潛能等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]?；谒赜懈叨茸晕腋录皾撛诘亩嘞蚍只膶傩裕蔀榛蛑委熀图?xì)胞治療的首選靶細(xì)胞[4]。全骨髓貼壁法是目前國(guó)內(nèi)采用分離MSC的較為普遍方法[5]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,要獲得活性好、形態(tài)均一穩(wěn)定的MSCs還應(yīng)注意嚴(yán)格的無(wú)菌操作,在提取原代的過(guò)程中尤為注意，必要時(shí)應(yīng)在培養(yǎng)基內(nèi)添加抗生素。L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中起重要作用，脫氨基后，L-谷氨酰胺可作為細(xì)胞培養(yǎng)的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成以及核酸代謝，谷氨酰胺缺乏有可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。因而L-谷氨酰胺的外源性添加很重要，是干擾細(xì)胞生長(zhǎng)周期及倍增時(shí)間的重要影響因素，在間充質(zhì)干細(xì)胞分裂中起重要作用[6]。培養(yǎng)液開(kāi)封后若在4℃儲(chǔ)存超過(guò)2周時(shí),應(yīng)注意添加L-谷氨酰胺溶液,否則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)不良和死亡現(xiàn)象。

目前尚未發(fā)現(xiàn)特異的抗原表型，可以用于直接鑒定MSCs[7]，間接通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、生長(zhǎng)周期及曲線、表面標(biāo)志以及多向分化等特點(diǎn)逆向推斷是否為MSCs[8]。地塞米松、吲哚美辛及異丁基甲基黃嘌呤等成脂肪誘導(dǎo)劑在體外對(duì)MSCs的作用，可以誘導(dǎo)分化形成脂肪細(xì)胞[9]。我們通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行分析，并通過(guò)成骨成脂肪誘導(dǎo)鑒定其為MSCs。

5-氮胞苷是胞嘧啶核苷酸的一個(gè)類(lèi)似物，具有良好的誘導(dǎo)分化的能力，不過(guò)對(duì)分化為不同的細(xì)胞，誘導(dǎo)條件是不同的。5-氮胞苷可能可以降低細(xì)胞DNA的甲基化水平，進(jìn)而與MSCs向心肌細(xì)胞分化的特異啟動(dòng)基因上的阻遏蛋白相結(jié)合，使后者去甲基化而發(fā)生構(gòu)型變化，使其向心肌細(xì)胞分化[2，10]。5-氮胞苷能夠有效誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，表達(dá)ɑ-肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T、肌間線蛋白和β-肌球蛋白[11]。

研究表明，HCN基因表達(dá)控制Na+，K+，Ga2+通道，竇房結(jié)細(xì)胞的自律性是由于其舒張期動(dòng)作電位4期能夠自動(dòng)除極化引起的，這個(gè)過(guò)程主要由超級(jí)化激活內(nèi)向陽(yáng)離子流（If）來(lái)完成。Plotnikov等[12]將轉(zhuǎn)染了 HCN2的人MSCs注入到完全房室傳導(dǎo)阻滯的狗左心室前壁，實(shí)驗(yàn)期間左心室心率明顯加快，轉(zhuǎn)染的人MSCs與周?chē)募〗M織建立縫隙連接，說(shuō)明了HCN2的重要性。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)5-氮胞苷誘導(dǎo)的SD-MSCs細(xì)胞能夠表達(dá)HCN2陽(yáng)性的細(xì)胞，為下一步的研究打下了基礎(chǔ)。

因此我們認(rèn)為利用全骨髓貼壁法提取的SD-MSCs，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行分析，并通過(guò)成脂肪誘導(dǎo)鑒定所提取的細(xì)胞為SD-MSCs。通過(guò)用10μmol/L的5-氮胞苷對(duì)SD-MSCs誘導(dǎo)24h后繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)HCN2的表達(dá)為陽(yáng)性，說(shuō)明其可能分化為具有起搏細(xì)胞功能的起搏樣細(xì)胞可能，不過(guò)仍然需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)其是否具有起搏功能，如進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行起搏電流的測(cè)定等。

[1] Pittenger MF,Mackay A M,Beck S C,et al.Mulitilineage potential ofadulthumanesenchymalstemcells[J].Science,1999,284(5411): 143-147.

[2] Fukuda K.Development of regenerative cardiomyocytes from msenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering[J]. Artificalorgans,2001,25(3):187-193.

[3] Chamberlain G,Fox J,Ashton B,et al.Concise Review:Mesenchymal stem cells their phenotype,differentiation capacity immunological features and potential for homing[J].Stem Cells, 2007,25(11):2739-2749.

[4]D'lppolito G,Diabira S,Howard G A,et al.Marrow-isolated Adult Multilineage Inducible (M IAMI)Cells,a Unique Population of Postnatal Young and Old Human Cells With Extensive Expansion and Differentiation Potential[J].J CellSci,2004,117:2971-2981.

[5] Neuhuber B,Swanger S A,Howard L,et al.Effects ofplating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics [J].Exp Hematol,2008,36(9):1176-1185.

[6] 唐明生,覃有振,戴剛,等.不同濃度谷氨酰胺對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J].新醫(yī)學(xué),2012,43(5):322-326.

[7] Peister A,Mellad J A,Larson B L.Adult Stem Cells from Bone Marrow(MSCs)Isolated from Different Strains of Inbred Mice Vary in Surface Epitopes,Rates of Proliferation,and Differentiation Potential[J].Blood,2004,103:1662-1668.

[8] 舒曉春,朱丹華,劉君靜，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,44(10):923-927.

[9] Rosen E D,Walkey C J,Puigserver P,et al.Transcriptionalregulation ofadipogenesis[J].Genes Dev,2000,14(11):1293-1307.

[10]Tomita Y,Makino S,Hakano D,et al.Application ofmesenchymal stem cell-derived cardiomyocytes as bio-pacemakers:current status and problems tobe solved[J].Med Biol Eng Comput, 2007,45(2):209-220.

[11] Haghani K,Bakhtiyari S.In vitro study of the differentiation of bone marrow stromal cells into cardiomyocyte-like cells[J].Mol CellBio Chem,2012,361:315-320.

[12] Plotnikov A N,Shlapakova I,Szabolcs M J,et al.Xenografted adult human mesenchymal stem cells provide a platform for sustained biologicalpacemaker function in canine heart[J].Circulation,2007,116(7):706-713.

Induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells by 5-azacytidine

DENG Liqun,SHEN Farong，JIN Hongfeng，et al.
the Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China

Mesenchymal stem cells The whole bone marrow adherence culture 5-azacytidine

2013-11-24）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目（02099）

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（鄧麗群）；浙江綠城心血管病醫(yī)院（沈法榮）；浙江醫(yī)院（金紅峰、王歡）

沈法榮，E-mail：shenfarong2011@163.com

【 Abstract】 Objective To induce rat bone marrow mesenchymal stem cells(SD-MSCs)with 5-azacytidine(5-aza). Methods The primary culture of SD-MSCs was isolated from the bone marrow of SD-rats by the whole bone marrow adhesion separation.The morphology ofSD-MSCs was observed with phase contrast microscopy.The cellcycle was analyzed by flow cytometry.The multilineage differentiation capability of SD-MSCs was examined by adipogenic differentiation method.SD-MSCs was induced by 5-aza,and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel(HCN2)in induced SD-MSCs was examined by immunohistochemistry and Western blot.Results Through isolation and culture,SD-MSCs developed a spindle appearance and had radiated colony growth.Growth curve of SD-MSCs presented S shape.SD-MSCs kept a high potential of multiplication.After adipogenic differentiation,lipid droplets presented red under oil red O staining.Immunohistochemistry and Western blot showed that SD-MSCs expressed positive for HCN2after induced by 5-aza. Conclusion SD-MSCs can be separated,proliferated and purified under the whole bone marrow adherence culture and 5-aza can successfully induce differentiation ofSD-MSCs.