霍山石斛 HPLC特征圖譜研究

魏 剛, 順慶生, 戴亞峰, 葉家宏, 李 濱, 黃月純, 何祥林, 楊明志

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué), 廣東 廣州 510006； 2.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510405；5.安徽霍山長(zhǎng)沖中藥材開(kāi)發(fā)有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中國(guó)中藥協(xié)會(huì)石斛專(zhuān)業(yè)委員會(huì), 云南 昆明 650031）

霍山石斛 HPLC特征圖譜研究

魏 剛1, 順慶生2, 戴亞峰3, 葉家宏1, 李 濱3, 黃月純4*, 何祥林5, 楊明志6

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué), 廣東 廣州 510006； 2.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510405；5.安徽霍山長(zhǎng)沖中藥材開(kāi)發(fā)有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中國(guó)中藥協(xié)會(huì)石斛專(zhuān)業(yè)委員會(huì), 云南 昆明 650031）

目的 建立霍山石斛 （ 霍山米斛） HPLC特征圖譜分析方法， 擬定黃酮類(lèi)成分指標(biāo)群。 方法 采用 Kromasil 100-5 C18色譜柱; 流動(dòng)相為 乙 腈-0.1% 磷 酸 溶液 （ 梯 度 洗脫） ; 檢 測(cè)波 長(zhǎng) 為 340 nm; 柱 溫 為 35 ℃; 體 積 流 量 1.0 mL/min。 結(jié)果 霍山石斛標(biāo)示出 24 個(gè)黃酮類(lèi)特征共有峰， 10 批樣品的相似度為 0.918 ～0.990， 相似度較高。 結(jié)論方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，本研究為霍山石斛的質(zhì)量控制提供了方法依據(jù)。

霍山石斛;黃酮類(lèi)成分;特征圖譜;高效液相色譜法

霍山石斛是石斛中最名貴的品種，也是最具代表性的品種。 清代趙學(xué)敏 《本草綱目拾遺》［1］（公元 1765 年， 清乾隆30年） 書(shū)中明確、 詳盡地闡釋了霍石斛， 其中記載:“ 《百草鏡》: 石斛近時(shí)有一種形短只寸許， 細(xì)如燈芯， 色青黃，咀之味甘，微有滑涎，系出六安州及穎州府霍山縣，名霍山石斛，最佳。其功長(zhǎng)于清胃熱，惟胃腎有虛熱者宜之，虛而無(wú)火者忌用?！冬幊踉?霍山屬六安州。其地所產(chǎn)石斛名米心石斛，以形如累米，多節(jié)，類(lèi)竹鞭，干之成團(tuán)。 他產(chǎn)者不能米心， 多不成團(tuán)也?！?因此霍山石斛又稱(chēng)霍山米斛。

霍山米斛野生資源由于遭到大規(guī)模的破壞，少見(jiàn)真影，直到本世紀(jì)八十年代， 才確定了其拉丁學(xué)名:Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng。 其中鑒定標(biāo)本就是由安徽霍山縣的何云峙先生所提供的。 2003 年包雪聲、 順慶生等出版 《霍山石斛》 一書(shū)， 兩位作者收集、 栽種、 觀察與鑒定的 （石斛） 種類(lèi)至少涉及有 50 種; 同時(shí)認(rèn)為:趙學(xué)敏、 趙學(xué)楷在 《本草綱目拾遺》 及 《百草鏡》 中所記述的霍石斛或霍山石斛，其指的植物性狀特征只能與霍山石斛 Dendrobium huoshanese C.Z.Tang et S.J.Cheng相互符合， 而不是指石斛屬其他種類(lèi)植物［2］。

霍山石斛局限分布于安徽省霍山縣及鄰近地區(qū)，以其味甘、黏質(zhì)厚之上乘品質(zhì)成為石斛中的極品，備受歷代醫(yī)家推崇［3］， 但目前尚未列入中國(guó)藥典。 《 本草綱目拾遺》中有對(duì)霍山石斛產(chǎn)品加工及應(yīng)用情況的明確記載。如 “彼土人以代茶茗” 的 “形曲不直” 的自然干燥產(chǎn)品， “有成毬 （球） 者……” 的人工卷曲加工產(chǎn)品， 而后者即為現(xiàn)代楓斗產(chǎn)品的前身［2］， 目前市場(chǎng)上的大量楓斗產(chǎn)品可能由此演變而來(lái)。由于霍山石斛獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境要求，以及歷代的采挖和近代生態(tài)環(huán)境的改變，其野生資源日趨稀少，瀕臨滅絕［4］。 導(dǎo)致市場(chǎng)上充斥各種假冒偽劣 “霍石斛”、 “霍斗”、 “金霍斛”， 因此研究一種真?zhèn)舞b別的技術(shù)非常必要。

目前真正在市場(chǎng)上出售的霍山石斛成品極少，常用細(xì)莖石斛等加工冒充成霍山石斛［5-6］。 由于難以得到真正的米斛成品，有關(guān)米斛質(zhì)量研究的報(bào)道更少。近年來(lái)霍山石斛人工栽培取得可喜進(jìn)展，在安徽霍山縣已經(jīng)開(kāi)始初步量產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)與霍山當(dāng)?shù)仄髽I(yè)合作，采用人工栽培成功的米斛開(kāi)展特征圖譜的研究，有利于規(guī)范霍山石斛的市場(chǎng)。課題組前期已開(kāi)展了鐵皮石斛［7］、 齒瓣石斛［8］、 兜唇石斛［9］等特征指紋圖譜的研究，本次在確保霍山石斛來(lái)源正品的基礎(chǔ)上， 采用 HPLC特征圖譜的分析技術(shù)來(lái)建立栽培霍山石斛特征圖譜，為確?；羯绞馁|(zhì)量提供依據(jù)，并初步比較了栽培品與野生品的差異。針對(duì)霍山地區(qū)常以銅皮石斛冒充霍山石斛的現(xiàn)狀，初步比較了霍山米斛與霍山產(chǎn)銅皮石斛特征圖譜差異。

1 儀器和試藥

四元泵、 柱溫箱、 二極管陣列檢測(cè)器和 Agilent1200 色譜工作站 （ Agilent 1200 高效液相 色 譜儀， 美國(guó) Agilent公司） ;Sartorius BP 211D 分析 天 平 （ 塞 多 利 斯天 平 有 限 公司）;KQ-400 KPE超聲波清洗儀 （ 功率 500 W， 頻率 40 kHz， 昆山市超聲儀器有限公司）。 9 批栽培霍山石斛 （編號(hào) S1 ～S9） 由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供， 1 批栽培霍山石斛 （編號(hào) S10） 由何祥林提供， 1 批野生霍山石斛 （編號(hào) S11） 及 1 批霍山栽培細(xì)莖石斛 （編號(hào) S12） 由安徽九仙尊霍山石斛股份有限公司提供?；羯绞?jīng)順慶生教授鑒定系霍山石斛 Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的 莖， 細(xì) 莖 石 斛 為 Dendrobium moniliforme（L.） Sw.的莖， 當(dāng)?shù)厮追Q(chēng)黃銅皮。 鮮品霍山石斛、 細(xì)莖石斛在60℃條件下減壓烘干， 備用。 乙腈為色譜純， 其他試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色 譜 柱 （ 250 mm×4.6 mm， 5 μm）; 流動(dòng)相由乙腈 （A） -0.1%磷酸溶液 （B）組成， 梯度洗脫 （0 ～30 min， 13% →18% 乙 腈;30 ～55 min， 18%→27%乙腈， 55 ～60 min， 27%→35%乙腈） ; 檢測(cè)波長(zhǎng) 340 nm; 柱溫 35 ℃; 體積流量 1.0mL/min。

2.2 供試品溶液 取霍山石斛粉末 （過(guò)四號(hào)篩） 1 g， 精密稱(chēng)定， 加甲醇 50 mL， 回流提取 4 h， 取出， 放冷， 濾過(guò)，濾液減壓蒸干，殘?jiān)蛹状际怪芙猓?置 2 m L量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，緩緩搖勻，即得。同法制備銅皮石斛的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取 5 μL同一供試品溶液， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次。 所得圖譜與對(duì)照模式的相似度均大于 0.99，顯示精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取 5 μL同一供試品溶液， 分別在 0、 3、 6、 9、 12、 24 h 進(jìn)樣。 所得圖譜與對(duì)照模式的相似度均大于 0.99， 顯示 24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取 6 份同一批樣品， 分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。所得圖譜與對(duì)照模式的相似度均大于0.99， 顯示重復(fù)性良好。

2.4 樣品檢測(cè) 精密吸收 5 μL供試品溶液， 同法進(jìn)樣分析。

2.5 特征圖譜的建立和分析

2.5.1 確定共有峰 根據(jù)以上 10 批霍山石斛的樣品的分析結(jié)果， 其 HPLC色譜均有 24 個(gè)特征共有峰， 計(jì)算各特征共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，以峰5為參照峰（S） 計(jì)算， 結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 霍山石斛 HPLC特征圖譜

2.5.2 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件 （2004A版） 進(jìn)行， 以均值數(shù)法生成10批栽培霍山石斛特征圖譜。 樣品相似度比較結(jié)果見(jiàn)表2。 10 批樣品 HPLC特征圖譜重疊圖及共有模式見(jiàn)圖 1 ～2。野生霍山石斛 （見(jiàn)圖 3） 除個(gè)別峰與栽培品不一致外， 絕大多數(shù)峰與栽培品一致，但相對(duì)峰面積比值有差異，與栽培霍山石斛特征圖譜對(duì)照模式的相似度為 0.839。 銅皮石斛 （見(jiàn)圖4） 主要為兩個(gè)較大的特征峰， 與霍山石斛有明顯差異。

表2 霍山石斛 HPLC特征圖譜的相似度

圖 1 10 批霍山石斛 HPLC的特征圖譜重疊圖

圖2 霍山石斛 HPLC的特征圖譜對(duì)照模式

圖3 野生霍山石斛的 HPLC特征圖譜

圖4 霍山銅皮石斛 HPLC色譜圖

3 討論

石斛為名貴藥材， 《中國(guó)藥典》 2010 年版收載石斛為金釵石斛、 鼓槌石斛、 流蘇石斛［10］， 并將鐵皮石斛單列?；羯绞菗?jù)考證石斛藥用歷史明確的四大石斛 （霍山石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、金釵花）之一，且是其中最具代表性的品種。 我們的系列研究表明可以采用 HPLC特征指紋圖譜有效區(qū)分不同的石斛［7-9］。

本實(shí) 驗(yàn) 比 較 了 Kromasil 100-5 C18柱 （ 250 mm × 4.6mm， 5 μm）、 ZOBAX SB Aq 柱 （250 mm×4.6mm，5 μm）、 ZORBAX SB C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） 的分離效果， 其中以 Kromasil 100-5 C18柱的 分 離 度較好; 考察不同柱溫 （25、 30、 35 和 40 ℃） 對(duì)分離效果的影響，結(jié)果以35℃效果最佳。 供試品溶液的制備比較了超聲處理及回流提取方法，對(duì)部分特征峰回流提取效果較好，而且濃縮處理較方便，確定采用回流方法。

本研究分析了10批栽培霍山石斛樣品， 各樣品均具有24個(gè)共有峰， 平均總共有峰面積百分比大于總峰面積的90%; 以均值法生成的共有模式為對(duì)照， 10 批樣品相似度大于 0.9， 表明栽培的霍山石斛具有比較穩(wěn)定的 HPLC特征圖譜，從而意味其質(zhì)量穩(wěn)定。研究還分析了1批野生霍山石斛，與栽培霍山石斛特征圖譜對(duì)照模式為對(duì)照，相似度為 0.839， 主要特征峰基本一致， 提示栽培成功可行; 與栽培品相比，野生霍山石斛峰數(shù)較豐富，特征峰相對(duì)比值有差異， 野生品的峰 3、 峰 6 相對(duì)比值較大， 而峰 12、 峰17號(hào)則幾乎未檢出。

此外，實(shí)驗(yàn)初步比較了1批霍山產(chǎn)銅皮石斛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與霍山石斛有非常明顯差異。課題組另對(duì)多批霍山產(chǎn)黃銅皮建立了特征圖譜，確實(shí)與米斛特征明顯不同。由于樣品量較少，野生與栽培霍山石斛特征圖譜規(guī)律性以及霍山石斛與銅皮石斛的差異性還有待進(jìn)一步研究及證實(shí)。由于霍山石斛價(jià)格昂貴，暫無(wú)法大量制取獲得對(duì)照品，霍山石斛黃酮類(lèi)成分的鑒別有待進(jìn)一步利用 LC-MS/MS 等技術(shù)對(duì)主要色譜峰進(jìn)行成分歸屬等研究。

［1］ 趙學(xué)敏.本草綱目拾遺［M］.北京: 人民衛(wèi)生出版社，1957:83.

［2］ 包雪聲， 順慶生， 周根余， 等.霍山石斛［M］.上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社， 2003:12-14.

［3］ 包雪聲， 順慶生， 陳立鉆.中國(guó)藥用石斛［M］.上海: 復(fù)旦大學(xué)出版社， 2001:75.

［4］ 劉守金， 武祖發(fā)，梁益敏， 等.霍山石斛的資源及生物學(xué)特牲［J］.中藥材， 2001， 24（10）::709-710.

［5］ 陳存武， 戴 軍，姚厚軍， 等.霍山石斛資源與鑒定研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐， 2013， 27（3）:84-87.

［ 6 ］ 劉志超.霍山石斛發(fā)展現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策［J］.園藝與種苗，2012（10）:13-16

［ 7 ］ 魏 剛， 劉宏源， 黃月純， 等.鮮鐵皮石斛 HPLC特征圖譜研究［J］.中成藥， 2012， 34（9）:1739-1743.

［ 8 ］ 黃月純， 楊麗娥， 魏 剛， 等.齒瓣石斛 HPLC特征圖譜［ J］ .藥物分析雜志， 2012， 32（11） :2071-2076.

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［10］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:85， 265.

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1001-1528（2014）12-2642-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.048

2014-06-03

魏 剛 （1969—）， 男， 研究員， 博士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥新藥研究與指紋圖譜分析。 Tel: （020） 39358519， E-mail: weigang021@163.com

*通信作者: 黃月純 （1968—）， 女， 主任中藥師， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與指紋圖譜分析。 Tel: （020）36591378， E-mail:huangyuechun@163.com