低氧誘導的非酒精性脂肪性肝炎動物模型的構(gòu)建

劉江　吳巍　何衛(wèi)美　朱偉華　劉春燕　董權(quán)　鄒偉華　李偉平

低氧誘導的非酒精性脂肪性肝炎動物模型的構(gòu)建

劉江吳巍何衛(wèi)美朱偉華劉春燕董權(quán)鄒偉華李偉平

【 摘要 】目的構(gòu)建低氧誘導的非酒精性脂肪性肝炎動物模型。方法50只大鼠分為正常組、低氧組、高脂組、低氧高脂組4組，分別給予正常飲食、腹腔內(nèi)注射亞硝酸鈉、高脂飲食、腹腔內(nèi)注射亞硝酸鈉+高脂飲食。檢測4組大鼠生化指標（ALT、AST、AKP、TG）、透明質(zhì)酸（HA）、動脈高鐵血紅蛋白及氧分壓，并行肝組織HE與Masson染色及NASH評分。 結(jié)果低氧高脂組大鼠的ALT、AST、AKP、TG、HA明顯升高，NASH評分明顯增加，肝組織可見明顯的脂肪變性、炎癥細胞浸潤及纖維化。結(jié)論高脂飲食大鼠誘導單純脂肪肝基礎上給予腹腔注射亞硝酸鈉能夠建立低氧誘導的非酒精性脂肪性肝炎動物模型。

【關鍵詞】低氧非酒精性脂肪性肝炎動物模型

近年來，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率日益增高，構(gòu)成嚴重的社會健康問題。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變，從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH），到肝纖維化和肝硬化。NASH是NAFLD進展為肝硬化的限速步驟，是隱源性肝硬化的重要病因。

NAFLD發(fā)生、發(fā)展的機制尚未明確，最具影響力的假說是由Day提出的“二次打擊”學說[1]。對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）患者的研究發(fā)現(xiàn)，低氧參與了NASH的發(fā)生、發(fā)展[2]。低氧條件下單純性脂肪肝向NASH進一步發(fā)展，可能恰恰是“二次打擊”的實例。然而，目前國內(nèi)外缺乏低氧條件下研究NASH機制的技術平臺。因此，建立低氧條件下的NASH動物模型，對于探討低氧在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用具有重要的意義。我們采用高脂飲食誘導的單純脂肪肝階段動物模型，加入低氧誘導，構(gòu)建了低氧誘導的NASH動物模型，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料和試劑清潔級SD大鼠50只，體重160～180g，雄性，購自遼寧長生生物技術有限公司。高脂飼料配方：基礎飼料80.5%、膽固醇2%、豬油7%、蛋黃粉10%、膽鹽0.5%，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。亞硝酸鈉購自成都市科龍化工試劑廠。AST、ALT、AKP、TG采用法國梅里埃生化儀檢測；透明質(zhì)酸（HA）放射免疫分析試劑盒購自上海海研醫(yī)學生物技術有限公司；大鼠高鐵血紅蛋白試劑盒購自上?；鈱崢I(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組將大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為4組。為避免實驗中大鼠死亡及出現(xiàn)疾病而數(shù)量過少，設定每組大鼠10～14只。各組喂養(yǎng)12周后予頸椎脫臼法處死取血及肝組織。（1）正常組：10只，普通飼料喂養(yǎng)12周；（2）低氧組：12只，普通飼料喂養(yǎng)8周，再給予普通飼料喂養(yǎng)+低氧條件誘導4周（腹腔注射亞硝酸鹽，40mg/kg，1次/d）；（3）高脂組：12只，以高脂飼料喂養(yǎng)12周；（4）低氧高脂組：14只，高脂飼料喂養(yǎng)8周，再給予高脂飼料喂養(yǎng)+低氧條件誘導4周（腹腔注射亞硝酸鹽，40mg/kg，1次/d），到實驗結(jié)束時，除低氧高脂組死亡1只大鼠，實際13只大鼠。其余各組大鼠均存活。1.2.2建立高脂飲食的單純脂肪肝階段動物模型大鼠給予高脂飼料（基礎飼料＋1%膽固醇＋5%豬油＋10%玉米油）喂養(yǎng)4周，可誘導建立單純脂肪肝模型（通過肝組織學驗證）。

1.2.3模擬間歇性低氧環(huán)境低氧組大鼠給予亞硝酸鹽40mg/kg，腹腔注射，1次/d，持續(xù)4周。腹腔注射時右手持注射器，左手的小指和無名指抓住大鼠的尾巴，另外3個手指抓住大鼠的頸部，使大鼠的頭部向下。腹腔注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離后從腹部一側(cè)進針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

1.2.4生化指標及纖維化指標檢測抽取鼠血清，檢測上述組別的ALT、AST、TG按常規(guī)在醫(yī)院生化儀檢測。HA按照說明書操作檢測。

1.2.5肝組織病理學檢查參照美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，進行NAFLD活動度積分和肝纖維化分期。采用HE染色和Masson染色，后者主要評價纖維化情況。由病理科2位醫(yī)師盲法閱片評價肝細胞脂肪變性、炎癥及纖維化程度，并進行NASH評分，取平均值作為最終NASH評分。肝細胞脂肪變分4級：0分：＜5%；1分：5%～33%；2分：34%～66%；3分：＞66%。大鼠肝組織壞死灶數(shù)評價炎癥程度：0分，無病灶；1分，少于2個病灶；2分，2個至4個病灶；3分，多于4個病灶。纖維化程度評分標準：無纖

維化：0分；肝腺泡3區(qū)輕、中度竇周纖維化或僅門靜周圍纖維化：1分；腺泡3區(qū)竇周纖維化合并門靜脈周圍纖維化：2分；橋接纖維化：3分；肝硬化：4分。

1.2.6高鐵血紅蛋白，動脈氧分壓測定我們展開了預實驗，來明確腹腔內(nèi)注射NaNO2后是否能夠誘導低氧的發(fā)生，并明確低氧能夠持續(xù)的時間。預實驗中在大鼠股動脈中置入硅膠管實時動態(tài)監(jiān)測注射NaNO2后大鼠高鐵血紅蛋和動脈氧分壓的變化。分別在腹腔內(nèi)注射NaNO2后0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h采血測定高鐵血紅蛋和動脈氧分壓。高鐵血紅蛋白檢測參照試劑盒說明書，動脈氧分壓在血氣分析儀上檢測。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料以表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.14組大鼠體重變化及存活率的比較4組大鼠隨著喂養(yǎng)時間增加，體重逐步增加，其中以高脂組增加最為明顯，其次為低氧高脂組、正常組，而低氧組體重增加最少，推測可能與低氧影響生長有關。低氧高脂組大鼠死亡1只，其余大鼠均存活，其余各組存活率均為100%。詳見表1。

表1　4組大鼠體重及存活率生化指標纖維化等比較

2.24組大鼠生化及纖維化指標的比較低氧高脂組的ALT、AST、AKP與正常組、低氧組、高脂組比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.01），而TG與正常組、低氧組比較有統(tǒng)計學差異，與高脂組比較無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。同時還發(fā)現(xiàn)低氧高脂組的纖維化指標HA明顯升高，與正常組、低氧組、高脂組比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.01），詳見表2。

表2　4組大鼠生化及纖維化指標的比較

2.3低氧大鼠高鐵血紅蛋和動脈氧分壓的變化大鼠注射亞硝酸鹽后15min高鐵血紅蛋白迅速上升并伴有動脈氧分壓下降，而2h后高鐵血紅蛋白又能夠迅速下降，動脈氧分壓逐步回升至正常（圖1）。因此，注射亞硝酸鹽后能夠建立反復的慢性低氧過程。

圖1　低氧組大鼠注射亞硝酸鹽后高鐵血紅蛋和動脈氧分壓的變化

2.44組大鼠肝組織學與NASH評分、纖維化評分4組大鼠在喂養(yǎng)12周后處死，進行病理學觀察。大體標本觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟組織肉眼為鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑。低氧組大鼠肝臟組織可見暗紅色，邊緣銳利，表面光滑。高脂組和低氧高脂組可見大鼠肝臟組織呈彌漫性腫大，表面色澤蒼白或帶灰黃色有大量紅黃相間的細顆粒，邊緣鈍而厚，切面呈黃紅或淡黃色，有油膩感。

顯微鏡下HE染色發(fā)現(xiàn)，正常組肝細胞正常，排列緊密。低氧組肝細胞排列紊亂，胞體增大，胞質(zhì)呈透明狀，胞核仍位于細胞中央，呈水樣變性，無脂滴空泡。高脂組可見明顯脂肪變性主要以大泡性脂滴為主，部分仍為小泡性脂滴空泡，其中部分肝細胞氣球樣變性。低氧高脂組有明顯的脂肪變性以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)小泡性脂滴為主，部分為大小泡混合型肝細胞脂肪變性及炎癥反應。膠原纖維Masson染色后在顯微鏡下表現(xiàn)為藍色，正常組、低氧組無纖維化，高脂組纖維組織增生不明顯，而低氧高脂組可見門脈周圍纖維化，部分可出現(xiàn)橋接纖維化（圖2）。因此，低氧高脂組大鼠出現(xiàn)了明顯的NASH特征；各組NASH評分比較，見表3。

圖2　4組大鼠肝組織病理檢查所見（上列為HE染色，×250；A：對照組，無脂肪變性，無炎癥細胞浸潤；B：低氧組4周，無脂滴空泡，肝細胞體積增大細胞質(zhì)透明，呈水樣變性；C：高脂組8周，炎細胞浸潤，肝細胞體積增大，胞質(zhì)疏松呈氣球樣變；D：高脂低氧組8周：肝細胞壞死，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不一、形態(tài)各異的脂滴空泡，炎癥細胞和脂肪細胞浸潤。下列為Masson染色，×250；E：對照組，無纖維化；F：低氧組4周，無纖維化；G：高脂組8周，無纖維化；H：高脂低氧組8周，肝細胞壞死，纖維組織增生明顯）

表3　各組NASH評分比較

由表3可見，低氧高脂組與高脂組大鼠在脂肪變性方面的評分明顯增加，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而在炎癥方面無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但總的NASH評分明顯增加，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。同時發(fā)現(xiàn)低氧高脂組與高脂組大鼠在纖維化方面也有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

3　討論

3.1NSAH病理特點單純性脂肪肝主要表現(xiàn)為甘油三酯的肝細胞內(nèi)大量沉積，但不伴有壞死、炎癥、纖維化或肝硬化，而NASH主要是一種繼發(fā)于肝細胞脂肪變性和細胞損傷的炎癥和纖維化狀態(tài)。典型的NASH組織學表現(xiàn)主要包括肝腺泡3區(qū)、大泡性為主的肝脂肪變，小葉內(nèi)輕度混合性炎癥細胞浸潤，鄰近脂變肝細胞的氣球樣變，竇周纖維化。大多數(shù)單純性脂肪肝患者疾病處于靜止狀態(tài)，而部分患者在“二次打擊因子”的作用下，進展或加速進展為NASH，導致病變進程加快。在我們的實驗中構(gòu)建的這個低氧誘導的NASH模型中能夠明顯見到NASH的病理特點。

3.2低氧參與了NASH進程低氧很有可能是非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制的“二次打擊因子”，低氧條件下單純性脂肪肝向NASH的進一步發(fā)展，可能恰恰是“二次打擊”的實例。在一項以101例擬行肥胖手術治療的病態(tài)肥胖患者的研究中，研究者調(diào)查OSAS對肝臟損害的影響，以氧飽和度指數(shù)（ODI）來評價OSAS的嚴重程度，肝活檢評價肝臟情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，校正其他危險因素（如胰島素抵抗）后，多因素分析提示ODI仍然與纖維化和非酒精性脂肪性肝病活動度評分相關。這個大型研究最終為慢性低氧參與NASH的發(fā)病機制提供了更多的證據(jù)，而且慢性低氧這個因素是獨立于胰島素抵抗[3]。然而，除了胰島素抵抗外，低氧導致NASH的確切機制沒有得到闡述。低氧狀態(tài)下，核轉(zhuǎn)錄因子（NFκB）和低氧誘導因子1（HIF1），可能部分參與脂變形成和炎癥反應[4]。低氧能夠上調(diào)無脂肪小鼠中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C（SREBP-1C）、硬脂酰輔酶A脫氫酶1（SCD-1）的表達水平[5]。在Pten缺陷小鼠中，低氧與NASH的發(fā)展和脂肪合成有關的基因，包括SREBP-1C和PPARγ過度表達以及線粒體β-氧化基因下調(diào)明顯相關[6]。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)高脂飲食8周誘導建立大鼠單純脂肪肝階段模型，再給予腹腔內(nèi)注射亞硝酸鹽能夠誘導低氧的發(fā)生。病理組織學的NASH評分結(jié)果表明，慢性低氧能夠在單純脂肪肝基礎上誘導NASH的發(fā)生，并加速NASH的進程。因此，很有必要進一步展開研究以探討其中的機制。

3.3動物低氧模型的建立方法建立動物低氧模型主要有2個方法，一是采用間歇性低氧飼養(yǎng)倉來誘導，這一方法的飼養(yǎng)倉比較接近OSAS患者的狀態(tài)，但是制備工藝復雜，目前市場上沒有成熟的產(chǎn)品；第二就是采用藥物來誘導，比如腹腔內(nèi)注射亞硝酸鹽，亞硝酸鹽能誘導血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力而引起組織低氧。本實驗中我們采用注射亞硝酸鹽的方法較好建立低氧動物模型。而且，從較長的觀察時間（如24h）來看，其實就是一種反復的慢性低氧過程。

總之，高脂飲食大鼠誘導單純脂肪肝基礎上給予腹腔注射亞硝酸鈉能夠建立低氧誘導的非酒精性脂肪性肝炎動物模型，并從生化指標、動脈氧分壓、肝組織學、纖維化指標等多層次驗證了模型NASH相關特點，從而為今后研究低氧對NAFLD/NASH疾病進程的影響創(chuàng)造良好的條件。

4　參考文獻

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-02-19）

基金項目：湖州市科技計劃項目（2012YSB01）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2013KYA197）

作者單位：313000湖州市中心醫(yī)院消化科

通信作者：李偉平，E-mail：liujiangxm2013@163.com

Establishment of animal model for hypoxia-induced non-alcoholic steatohepatitis

LIU Jiang,WU Wei,HE Weimei,et al.Department of Gastroenterology,Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China

【 Abstract】ObjectiveTo establish a animal model for hypoxia-induced non-alcoholic steatohepatitis.MethodsRats were randomly assigned to a normal diet(control group),normal diet+intraperitoneal injection of sodium nitrite(hypoxia group), high fat diet(high fat group),intraperitoneal injection of sodium nitrite+high fat diet(hypoxia+high fat group),respectively.Biochemical markers including alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),total triglycerides(TG)and liver fibrosis marker hyaluronic acid(HA),methemoglobin and arterial oxygen partial pressure were detected.In addition,liver tissue HE and Masson staining and NASH score were performed.ResultsThe levels of ALT,AST,TG,HA and NASH score were significantly increased in hypoxia+high fat group.Steatosis,inflammatory infiltration and fibrosis was observed in liver tissues of hypoxia+high fat group.ConclusionIntraperitoneal injection of sodium nitrite can establish a hypoxia-induced non-alcoholic steatohepatitis animal model on the basis of high fat diet.

【Key words】Non-alcoholic steatohepatitisHypoxiaAnimal model