Toll樣受體2、3、4、9在胎盤組織中的表達(dá)及其與自發(fā)性早產(chǎn)的關(guān)系

黃堅(jiān)　王玨　林珍云　商宏愷　馬林　卓廣超　馮國(guó)芳　張治芬

Toll樣受體2、3、4、9在胎盤組織中的表達(dá)及其與自發(fā)性早產(chǎn)的關(guān)系

黃堅(jiān)王玨林珍云商宏愷馬林卓廣超馮國(guó)芳張治芬

【摘要 】目的探討Toll樣受體（TLRs）2、3、4、9在不同孕期胎盤組織中的表達(dá)及其與自發(fā)性早產(chǎn)的關(guān)系。 方法選擇自發(fā)性早產(chǎn)患者的胎盤樣本38份作為早產(chǎn)組（其中孕28-34周和孕35～36周各19份）。選擇同期正常妊娠自然分娩產(chǎn)婦的胎盤樣本38份（孕37-40周）作為對(duì)照組。采用real-time PCR法檢測(cè)兩組胎盤中TLR 2、3、4、9 mRNA的表達(dá)，并用Western blot法檢測(cè)胎盤中TLRs 2、3、4、9蛋白的表達(dá)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 （1）兩組孕產(chǎn)婦胎盤組織中均可檢測(cè)到TLRs 2、3、4、9的表達(dá)。（2）早產(chǎn)組胎盤組織TLR 2、3、9 mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；TLR4 mRNA的表達(dá)兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。（3）早產(chǎn)組TLR 2、3、4、9的蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。（4）早產(chǎn)組中，28～34孕周組和35～36孕周組胎盤中TLRs mRNA表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。 結(jié)論早產(chǎn)患者胎盤組織中TLRs過(guò)度表達(dá)，提示TLRs介導(dǎo)的母胎界面的免疫反應(yīng)可能是啟動(dòng)自發(fā)性早產(chǎn)的重要因素。

【關(guān)鍵詞 】Toll樣受體早產(chǎn)免疫反應(yīng)胎盤

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptors(TLRs)in placenta and its relationship with spontaneous preterm labor.MethodsThirty eight placental samples were collected from patients with spontaneous preterm labor(preterm group),including 19 of 28～34 week gestation,and 19 of 35～36 week gestation.Thirty eight placental samples from normal pregnancy and natural delivery(37～40 week)served as control group.The mRNA expressions of TLR 2,3,4,and 9 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR);and the protein expression of TLR2,3,4,and 9 were evaluated by Western blot.ResultsThe mRNA expressions of TLR2,3,9 in preterm group were significantly higher than those in control group(P＜0.05),but not for TLR4(P＞0.05).The protein expressions of TLR2,3,4 and 9 also showed higher in preterm group than those in control group(P＜0.05).ConclusionThe over-expressed TLRs in preterm placental tissue suggests that the immune response mediated by TLRs in the maternal-fetal interface may be important factors to initiate spontaneous preterm labor.

【 Key words】 Toll-like receptorsPreterm birthImmune responsePlacenta

早產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。近年來(lái)研究表明，自發(fā)性早產(chǎn)的發(fā)生可能是促炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)母胎界面炎癥反應(yīng)，使胎兒失去免疫保護(hù)并被母體內(nèi)源性免疫排斥的結(jié)果。胎兒和母體對(duì)各種因素刺激產(chǎn)生的免疫內(nèi)分泌反應(yīng)可能是關(guān)鍵原因。目前認(rèn)為，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在內(nèi)源性免疫系統(tǒng)中起著重要作用，與自發(fā)性早產(chǎn)密切相關(guān)[1]。

TLRs是天然免疫中重要的模式識(shí)別受體，通過(guò)對(duì)病原微生物的病原相關(guān)分子模式的識(shí)別激活先天性免疫應(yīng)答,在機(jī)體抵擋病原體感染中發(fā)揮重要作用。在母體胎盤界面，TLRs在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞（如滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞）上均有表達(dá)，表達(dá)模式隨妊娠階段的變化而改變[2]。本研究通過(guò)比較TLRs在早產(chǎn)及足月產(chǎn)的胎盤組織核酸及蛋白水平的表達(dá)，探討TLRs表達(dá)量的變化與自發(fā)性早產(chǎn)的關(guān)系及早產(chǎn)發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制。

1　對(duì)象和方法

1.1對(duì)象2011-08—2012-08在我院產(chǎn)科住院分娩的自發(fā)性早產(chǎn)患者38例，收集其胎盤組織共38份為早產(chǎn)組。其中孕28~34周早產(chǎn)患者的胎盤組織19份，孕35～36周早產(chǎn)患者的胎盤組織19份。早產(chǎn)組的初始癥狀均為胎膜早破，隨后出現(xiàn)陣發(fā)性腹痛，最終導(dǎo)致早產(chǎn)。早產(chǎn)組孕婦年齡20～35（27.89±1.09）歲；孕周28～36（33.95±0.93）周。選擇同期在我院正常妊娠足月自然分娩的孕婦38例，收集其胎盤組織38份為對(duì)照組。對(duì)照組孕婦年齡23～32（26.58±0.77）歲；孕周37～41（38.92± 0.34）周。兩組孕婦年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組孕婦均無(wú)母體疾病，胎位均為頭位，產(chǎn)時(shí)無(wú)胎盤早剝、前置胎盤、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒先天畸形以及頭盆不稱、胎兒窘迫等產(chǎn)科并發(fā)癥。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本取樣胎盤組織于分娩30min內(nèi)取樣，組織大小約1cm×1cm×1cm，避開梗死、出血、鈣化灶。置于無(wú)菌試管內(nèi)，存于-70°C冰箱備用。

1.2.2real-time PCR法檢測(cè)TLRs mRNA在胎盤組織中的表達(dá)取50~100mg組織加入1ml Trizol液（美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品）按說(shuō)明書提取組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司產(chǎn)品）說(shuō)明書將總量約5μgRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增。用于RT-PCR的TLRs和GAPDH的引物見表1。

表1　用于RT-PCR的TLRs和GAPDH的引物

使用ABI PRISM 7500檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems，US），程序設(shè)定為：（1）50℃2min；（2）95℃10min；（3）變性15s再延伸60s，循環(huán)40次；（4）熒光信號(hào)的收集是在每個(gè)延伸階段；（5）擴(kuò)增結(jié)束后將溫度提高到60～95℃做產(chǎn)物的溶解曲線。用序列檢測(cè)軟件V1.3.1來(lái)確定樣本在C（t）值上的均值和差異性。數(shù)據(jù)分析以2-ΔΔCt的方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次試驗(yàn)取平均值。結(jié)果根據(jù)軟件的結(jié)果以圖形的形式表示。1.2.3Western blot法檢測(cè)TLRs蛋白在胎盤組織中的表達(dá)將組織冰上勻漿提取總蛋白，取20μl蛋白提取物加入5μl上樣緩沖液，按次序?qū)悠纺z電泳（PAGE）膠中。100V電泳120min。PVDH膜80V電轉(zhuǎn)120min后再加入第一抗體鼠TLR2單克隆抗體或羊TLR3單克隆抗體或羊TLR4單克隆抗體或鼠TLR9單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶200）室溫孵育120min后，采用相對(duì)應(yīng)的第二抗體：山羊抗鼠TLR2、TLR9 IgG（美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶4 000）或驢抗羊TLR3、TLR4 IgG（美國(guó) Santa Cruz公司，濃度為1∶4 000）室溫孵育120min。最后經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)熒光發(fā)光法顯影（美國(guó)Millipore公司），并用Quantity One分析系統(tǒng)拍照分析。顯影拍照后陰性對(duì)照以PBS緩沖液沖洗5次，每次5min，再加入兔源抗人GAPDH第一抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶1 000）和山羊抗兔的第二抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶5 000），然后再次如前所述的方法進(jìn)行顯影和拍照分析。TLR2、TLR3、TLR4和TLR9蛋白的相對(duì)分子量分別為90~100、117、95和180kDa。

1.3早產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)妊娠滿28至不滿37足周之間（196～258d）發(fā)生的分娩[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用表示，先采取方差分析，方差齊則采用t檢驗(yàn)，方差不齊則采用U檢驗(yàn)，計(jì)量資料不符合正態(tài)分布則采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1胎盤組織中TLRs mRNA的表達(dá)量運(yùn)用realtime PCR技術(shù)結(jié)果顯示，兩組的胎盤組織中均有TLRs 2、3、4、9 mRNA的表達(dá)。對(duì)照組胎盤組織中，TLR4的mRNA表達(dá)量最高，TLR2的mRNA表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。早產(chǎn)組中，TLR4與TLR9的mRNA表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但都明顯高于TLR2與TLR3的mRNA表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。早產(chǎn)組TLR2、TLR3、TLR9的mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），TLR4的mRNA表達(dá)量?jī)山M間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖1。早產(chǎn)組中，28~34孕周組和35~36孕周組的TLRs mRNA表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見表2。

2.2兩組胎盤組織TLR2、3、4、9蛋白的表達(dá)對(duì)照組TLR 2、3、4、9蛋白表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），早產(chǎn)組中TLR9蛋白表達(dá)量最高，TLR2蛋白表達(dá)量最低，見圖2。早產(chǎn)組胎盤組織中TLR 2、3、4、9蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3、圖3。

圖1　兩組胎盤組織中TLRs mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（*P＜0.05）

表2　TLRs在不同孕周早產(chǎn)胎盤組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

圖2　兩組胎盤組織中TLRs蛋白表達(dá)量的比較

表3 兩組胎盤組織中TLR2、3、4、9蛋白（TLRs/GAPDH）表達(dá)的比較

3　討論

TLRs是一類進(jìn)化保守的胚系編碼的模式識(shí)別受體，主要在具有免疫功能的組織中表達(dá)，通過(guò)識(shí)別并結(jié)合不同的細(xì)菌或病毒的分子結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫和引起獲得性免疫反應(yīng)[4]。在機(jī)體抵擋病原體感染中起到至關(guān)重要的作用。TLRs最初于上世紀(jì)80年代在果蠅身上發(fā)現(xiàn)，直到1996年才在人類組織中發(fā)現(xiàn)，到目前為止共鑒定出11種TLRs（TLR1－11）[5]。不同的TLRs受體通常與不同種類病原體的配體結(jié)合，而且可能直接對(duì)特殊種類病原體產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)。例如，TLR2可識(shí)別來(lái)源于細(xì)菌的二及三軟脂酰肽，TLR3識(shí)別病毒感染細(xì)胞釋放的雙鏈RNA,TLR4識(shí)別脂多糖成分脂質(zhì)A，TLR9可以使免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)菌中常見的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸反應(yīng)[6]。目前研究認(rèn)為，感染所致的免疫平衡被打破是分娩過(guò)早啟動(dòng)最常見的原因。生殖道感染在導(dǎo)致伴有胎膜早破的自發(fā)性早產(chǎn)方面起的作用可能遠(yuǎn)大于目前的估計(jì)。

從免疫學(xué)角度而言,妊娠期胎兒作為同種異體移植物種植在母體，母體對(duì)胎兒產(chǎn)生特異性免疫耐受。胎兒能在子宮內(nèi)保持其免疫原性的機(jī)制主要在于精密調(diào)節(jié)母胎界面細(xì)胞因子的水平[7]。研究表明，多種因素（尤其是感染）可以通過(guò)母體TLRs的介導(dǎo),引起母胎界面促炎癥細(xì)胞因子上升，打破母胎間的免疫耐受，導(dǎo)致母體對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫排斥，過(guò)早激活分娩機(jī)制而導(dǎo)致自發(fā)性早產(chǎn)[8]。目前，TLRs如何調(diào)節(jié)母體胎兒分界面的炎癥反應(yīng)尚處于研究的起步階段，但越來(lái)越多的證據(jù)證明滋養(yǎng)層細(xì)胞可以通過(guò)TLRs受體的表達(dá)來(lái)識(shí)別病原體并作出應(yīng)答[9-10]。胎盤作為母胎間的一個(gè)重要器官，是特殊的先天性免疫器官，在抵御外來(lái)病原菌入侵中起重要作用。研究胎盤上TLRs表達(dá)的變化有助于探討其與早產(chǎn)啟動(dòng)之間的關(guān)系。Soboll等[5]已證實(shí)人類胎盤有TLR 1～10的表達(dá)。小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其他身體部位的感染亦可增加胎盤內(nèi)TLRs表達(dá)的增加，這種反應(yīng)提示TLRs可能是母胎界面的一種敏感免疫保護(hù)機(jī)制[11]。Patni等[12]在足月順產(chǎn)及剖腹產(chǎn)的胎盤上發(fā)現(xiàn)TLR1~10的mRNA表達(dá)，在對(duì)胎盤組織進(jìn)行培養(yǎng)，給予TLR2、3、4、5、7、8、9相應(yīng)的激動(dòng)劑刺激后，除CpG的刺激外，其余均能產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子釋放，顯示這些受體是功能受體。本研究運(yùn)用Real-Time-PCR和Western blot技術(shù)對(duì)早產(chǎn)組和對(duì)照組孕婦的胎盤組織中的TLRs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)兩組樣本在mRNA和蛋白水平上均有TLR 2、3、4、9的表達(dá)。

圖3　兩組胎盤組織中TLRs蛋白表達(dá)量的比較（*P＜0.05）

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組胎盤上TLRs各種亞型的表達(dá)水平亦存在差異。早產(chǎn)組TLR2、3、9 mRNA的表達(dá)水平和TLR2、3、4、9蛋白的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組。如圖1所示，早產(chǎn)組TLR4的mRNA表達(dá)量最高，且在早產(chǎn)組中的表達(dá)量保持相對(duì)穩(wěn)定，因此該亞型的分子結(jié)構(gòu)可能是TLRs中相對(duì)保守的一種，并不輕易隨著周圍環(huán)境的變化而變化，它可能對(duì)維持TLRs基本功能起到重要作用。此外，早產(chǎn)組胎盤中TLR2、3、9的表達(dá)量都明顯增加，提示TLR2、3、9可能在早產(chǎn)啟動(dòng)中起到了促進(jìn)作用，其中早產(chǎn)組TLR2與TLR9的表達(dá)量增高約2倍，明顯高于TLR3在早產(chǎn)孕婦中的增量，因此TLR2和TLR9在誘發(fā)早產(chǎn)的機(jī)制中可能起到了更為重要的作用。圖2所示，TLR2、3、4、9的蛋白表達(dá)量在對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示經(jīng)過(guò)蛋白修飾表達(dá)后，各亞型表達(dá)量保持相對(duì)一致的水平。而在早產(chǎn)組中，4種亞型均有明顯升高，提示4種TLRs亞型均在早產(chǎn)中發(fā)揮了介導(dǎo)感染的作用。而TLR4的mRNA表達(dá)量在早產(chǎn)組和對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示該亞型可能是在蛋白水平發(fā)揮作用，或者是TLR2、3、9的促進(jìn)/激活下，進(jìn)一步發(fā)揮的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)組TLRs 4種亞型的表達(dá)量并未因孕周的早晚而發(fā)生改變，如表2所示，更早孕周（28～34周）早產(chǎn)的胎盤組織中TLRs的表達(dá)量與接近足月孕周（35～36周）胎盤中的TLRs表達(dá)量相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中機(jī)制尚難以解釋，設(shè)想TLR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能并非具有累積效應(yīng)，也不是逐漸加重的，而更像是在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生后即導(dǎo)致了早產(chǎn)的發(fā)生。TLRs在早產(chǎn)的不同階段是否存在差異尚需大樣本實(shí)驗(yàn)予以進(jìn)一步闡明。

綜上所述，我們認(rèn)為TLRs介導(dǎo)的母胎界面的免疫反應(yīng)可能是自發(fā)性早產(chǎn)啟動(dòng)的重要因素。研究結(jié)果支持“TLRs介導(dǎo)的早產(chǎn)生化級(jí)鏈模式學(xué)說(shuō)”[13]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，TLRs識(shí)別細(xì)菌主要成分和應(yīng)激蛋白,從而破壞細(xì)胞、增加一系列促炎癥因子的生成。并且，由于生殖道的微生物感染往往導(dǎo)致絨毛膜羊膜炎，使胎膜脆性增加、局部張力下降，繼而可發(fā)生胎膜早破。這些促炎癥因子的相互作用，使中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞游移至母胎界面的量增加，過(guò)度的應(yīng)激蛋白和微生物感染一旦超過(guò)母胎間免疫保護(hù)機(jī)制的閾值，就會(huì)破壞母胎間的免疫平衡，引起自發(fā)性早產(chǎn)。TLRs在早產(chǎn)免疫機(jī)制學(xué)說(shuō)中的重要作用，為今后預(yù)防和治療早產(chǎn)提供了依據(jù)。

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-01-07）

基金項(xiàng)目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金（2009A162）

作者單位：310006杭州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（黃堅(jiān)、王玨、林珍云、商宏愷、馬林、馮國(guó)芳、張治芬），檢驗(yàn)科（卓廣超）

通信作者：黃堅(jiān)，E-mail：huangjian168@msn.com

Expression of Toll-like receptors 2,3,4,9 in placenta and its relation to spontaneous preterm labor

HUANG Jian,WANG Jue,LIN Zhenyun,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China